杆菌科细菌的耐药基因的流行情况分析

碳青霉烯类抗菌药物一直是产超广谱β内酰胺 酶（ESBLs）或 AmpC 酶的肠杆菌科细菌治疗首选药 物，也被认为是最后的防线 。随着该类抗菌药物 的 广 泛 使 用 ，临 床 耐 碳 青 霉 烯 类 肠 杆 菌 科 细 菌 （CRE）菌株对碳青霉烯类抗菌药物的耐药率逐年升 高，这在很大程度上限制了该类抗菌药物的使用，造 成了药物使用的困难 。

1 材料与方法 

1. 1 菌株来源

收集 2018 年 1—12 月重庆市某三 甲医院临床分离的非重复肠杆菌科细菌1 202株。阳 性对照菌株为 5 株重庆医科大学附属儿童医院分离 的碳青霉烯酶基因阳性肺炎克雷伯菌，包括 bla KPC-2、 bla IMP-1、bla VIM-2、bla NDM-1和 bla OXA-48 5 种基因型，阴性对 照菌株为实验室保存的标准菌株大肠埃希菌 ATCC 25922。

1. 2 仪器与试剂

仪器：VITEK-MS 质谱仪和 VITEK-2 Compact 全自动微生物鉴定药敏仪（均为法 国生物梅里埃公司生产），GNP29270 型恒温培养箱 （上海精宏实验室设备有限公司生产），CFX96 荧光 定量 PCR 扩增仪和 Bio-Rad ChemiDoc XRS 凝胶成 像系统（均为美国 Bio-Rad 公司生产），BG-subMIDIv）可见光电泳—透射仪（北京百晶公司生产）。试 剂：血琼脂平皿购于英国 OXOID 公司，VITEK-MS CHCA基质液购于法国生物梅里埃公司，Premix Taq™ 酶和 DNA Marker 均购于大连宝生生物公司，5 种基 因的引物由重庆擎科兴业生物技术有限公司合成。

1. 3 CRE 菌株鉴定及药敏试验

将 61 株 CRE 菌株 均经 VITEK-MS 质谱仪鉴定到种，再通过 VITEK-2 Compact 进行药敏试验，并用最小抑菌浓度（MIC）法 测定其对 14 种常用抗菌药物的敏感性，参照 2018 版 CLSI-M100 标准判读结果，本研究将对亚胺培南耐 药的肠杆菌科细菌定义为 CRE，并对各种抗菌药物 耐药率进行数据分析。

1. 4 检测 CRE 菌株的碳青霉烯酶基因

（1）模板 制备：CRE 菌株 DNA 采用煮沸法提取，放-20 ℃冰箱 保存备用。（2）碳青霉烯酶基因的 PCR 检测：以 CRE 菌 株 DNA 为 模 板 分 别 对 bla KPC-2、bla IMP-1、bla VIM-2、 bla NDM-1 和 bla OXA-48 5 种基因型进行 PCR 扩增，反应 条件参照进行。PCR 反应体系 为 25 μL，包括 12. 5 μL Taq PCR Master Mix，2 μL 上 下游引物，1 μL DNA 模板，9. 5 μL ddH2O。PCR 反应 条件为先 94 ℃预变 5 min，再 94 ℃变性 30 s，55 ℃退 火 30 s，72 ℃延伸 30 s 或者 60 s（具体根据产物长度 而定）；变性、退火、延伸 30 个循环；最后 72 ℃继续延 伸 7 min。将 PCR 扩增产物置于 2. 0%琼脂糖凝胶电 泳25 min，然后再通过凝胶成像仪观察结果。（3）碳 青霉烯酶基因测序：将 PCR 扩增阳性的产物送深 圳华大生物技术有限公司进行测序，将测序所得 的序列与 GenBank 核酸数据库进行 BLAST 序列比 对，将相似度最高的基因型作为待测细菌的基因 类型。

1. 5 统计学方法

采用 WHONET 5. 6 软件进行统 计分析。

2 结 果

2. 1 CRE 菌株鉴定及药敏试验结果

采用 WHONET 5. 6 软件对药敏资料进行统计分析，分离得到61 株 CRE 菌株，其中肺炎克雷伯菌 51 株（83. 6%）、 阴沟肠杆菌 6 株（9. 8%）、大肠埃希菌 4 株（6. 6%）， 61 株 CRE 菌株的科室及种类分布；同时，药 敏结果显示，61 株 CRE 菌株对 14 种抗生素的耐药率 分别为亚胺培南（100. 0%），氨苄西林/舒巴坦（100. 0%）， 头孢曲松（100. 0%），头孢他啶（100. 0%），头孢替坦 （91. 5%），头孢吡肟（93. 9%），哌拉西林/他唑巴坦 （91. 5%），氨曲南（95. 5%），复方新诺明（81. 3%），庆 大霉素（81. 3%），妥布霉素（73. 2%），环丙沙星（79. 3%）， 左旋氧氟沙星（58. 5%），阿米卡星（57. 7%），61 株 CRE 菌株对临床常用抗生素呈高度耐药，除了对左旋氧 氟沙星和阿米卡星的耐药率低于 60.0%，对大部分抗 生素的耐药率都大于80.0%。

2. 2 碳青霉烯酶基因检测结果

61 株 CRE 菌株中 共检测出 bla KPC-2 基因型 50 株，bla NDM-1 基因型 9 株， bla OXA-48基因型4株，未检测出bla IMP-1基因型和bla VIM-2 基因型。

3 讨 论

肠杆菌科细菌作为社区和院内感染的重要病原 菌，可引起呼吸道、尿路以及菌血症等各种部位的感 染。碳青霉烯类抗菌药物对大多数产超广谱β内酰 胺酶和质粒介导的 AmpC 酶具有较高的稳定性，是 目前治疗革兰阴性菌抗菌谱最广、抗菌活性最强的 一类抗菌药物。但是随着该类药物大量使用甚至过 度治疗，临床耐药现象已在肠杆菌科细菌中开始出 现，并呈逐年增加趋势，且耐药范围已从欧洲、北美 等地区扩大到中国，菌种也扩展至多种不同种属的 肠杆菌科细菌 。2018 年全院共 分离出 61 株 CRE 菌株，其中耐碳青霉烯类肺炎克雷 伯菌 51 株，占 83.6%，说明该院主要感染 CRE 菌株呈 优势性病原菌感染流行趋势，这与 CHINET 中国细 菌耐药监测网统计结果基本一致。该情况仍值得 临床密切关注并采取有效的控制措施，避免重复给 药、超适应证给药等错误行为的发生。

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