盐酸莫西沙星原料药微生物限度检测办法考证

盐酸莫西沙星为第四代新型喹诺酮类抗菌药物，具 有广谱抗菌活性，抗菌的作用机制为抑制拓扑异构酶Ⅱ 和拓扑异构酶Ⅳ，阻断细菌 DNA 合成，主要优势是耐 药性极低，为 1.8×10-9~1×10-11，特别是不易与其他喹诺 酮类抗生素产生交叉耐药。与第三代喹诺酮类药物相比， 它进一步提高了对革兰阳性菌如肺炎球菌的抑制活性， 同时也可以有效抑制厌氧菌。抗非发酵菌（假单胞菌属 和洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）除外）、葡 萄球菌、肺炎链球菌、肠球菌和厌氧菌的活性是环丙沙 星和氧氟沙星的 2~16 倍 ；抗大肠埃希菌的活性是环丙沙星的 50%，而抗沙眼衣原体、肺炎衣原体和支原体的活 性都比环丙沙星高。盐酸莫西沙星开发的制剂包括片 剂，滴眼液，注射液，疗效显著。

于盐酸莫西沙星自身的抗菌活性，常规检测方法 未必能真实反映其原料药中的微生物负载，但药品微生 物限度是药品安全性的重要指标之一，法规文件也对此 提出了明确要求。所以，进行微生物限度检查时，要 求供试品自身在试验的条件下能有效排除其抑菌作用， 使其不干扰染菌的限度检验，检测方法通过验证可以确 认供试品所采用的检查方法和检验条件适用。

为消除盐酸莫西沙星的抑菌活性，准确检测出每克 原料实际微生物负载量，本研究确认培养基适用性之后， 采用薄膜过滤法，选择氯化镁溶液作为中和剂，并以聚 山梨酯 80 作为中和剂同时比较，旨在验证该方法适用于 盐酸莫西沙星原料药中微生物限度的检测。

实验所用菌株为即用型定量菌株，金黄色葡萄 球 菌 CMCC(B)26003（批号 20181008）；枯 草 芽 胞 杆 菌 CMCC(B)63501（批号 20180908）；铜 绿 假 单 胞 菌 CMCC(B) 10104（批号 20180809）；白 色 假 丝 酵 母 CMCC(F) 98001（批号 20180904）；黑 曲 霉 CMCC(F) 98003（批号 20180817）。以上菌株均为 3 代，全部购 自浙江泰林生物技术股份有限公司。其冻干粉直接用商 品配套溶液复溶，配制成菌悬液浓度为每 0.1 ml 不超过 100 cfu。 胰酪大豆胨琼脂培养基（批号 20181025）和沙氏葡 萄糖琼脂培养基（批号 20170837），均购自浙江泰林生 物技术股份有限公司 ；胰酪大豆胨琼脂对照培养基（批 号 135025-201603）和沙氏葡萄糖琼脂对照培养基（批 号 135013-201502），购自中国食品药品检定研究院。

盐酸莫西沙星原料（印度瑞迪实验制药股份有限公 司，批号 ABKH005846），氯化镁（国药集团化学试剂 有限公司，批号 20181130），pH 7.2 无菌磷酸盐缓冲液（自 制，批号 20181127）。

BHC-1300IIA2 生物安全柜（苏州时金净化设备科 技有限公司）；生化培养箱（上海精宏实验设备有限公司）； ES-315 全自动灭菌锅（日本 Tomy 公司）；KBF220 一次 性使用集菌过滤培养器（温州维科生物实验设备有限公 司）；XK97-A 菌落计数器（邦西仪器科技（上海）有限 公司）。

按定量菌株要求分别配制好菌悬液，使每 0.1 ml 菌 液浓度不超过 100 cfu ；按照培养基说明书要求，配制好 培养基。取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和枯草芽胞 杆菌菌悬液各 0.1 ml，分别各注入 2 个无菌平皿中，立 即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，混匀，凝固，于 30~35 ℃倒置培养 3 d。白色假丝酵母和黑曲霉同法操作菌，但于 30~35 ℃倒置培养 5 d ；同时，还将他们置于沙氏葡萄 糖琼脂培养基 20~25 ℃培养 5 d。细菌和真菌均须用相应 的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。 逐日观察需氧菌和真菌的菌落生长情况，进行菌落 计数，取平均值计算比值。观察比较试验菌在被检培养 基上与相应的对照培养基上的菌落的数量、形态和大小。

称量盐酸莫西沙星原料 10 g，溶于 1 000 ml pH 7.2 无菌磷酸盐缓冲液，作为 1 ∶ 100 的供试液。 1）试验组 取供试液 100 ml 与 0.1 ml 的金黄色葡 萄球菌的菌悬液混匀，过滤，用 700 ml pH 7.2 无菌磷酸 盐缓冲液冲洗，每次 100 ml，冲洗 7 次 ；将滤膜取出， 菌面向上，贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上（平行制 备 2 个平皿），于 30~35 ℃倒置培养不超过 3 d，进行菌 落计数。铜绿假单胞菌和枯草芽胞杆菌同法操作。而白 色假丝酵母和黑曲霉须同法操作各制备 2 张滤膜，分别 贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿和沙氏葡萄糖琼脂培养 基平皿上，置于 30~35 ℃和 20~25 ℃倒置培养不超过 5 d。 2）菌液对照组 取稀释液 100 ml 代替供试液，加 入 0.1 ml 的菌悬液（不超过 100 cfu），混匀，过滤，按 试验组同法操作。 3）供试品对照组 取供试液 100 ml，不接入试验菌， 按照试验组同法操作。 4）空白对照组 用稀释液 100 ml 代替供试液，不 接入试验菌，按照试验组同法操作。 试验组菌数回收率 =（试验组菌落数 - 供试品对照 组菌落数）/ 菌液对照组菌落数 ×100%。 上述试验独立平行操作 3 次。

分别以 4.0% 聚山梨酯 80 和 2 mol/L 氯化镁为中和 剂，各组每 100 ml 培养基中加入了 5 ml 中和剂，其余 按 1.4.2 操作。

被检与对照培养基菌落平均数的比值均在 0.5 ～ 2 范围内，且菌落形态大小与对照培养基的菌落一致（表 1），说明培养基适用性检查符合要求。

2.2 不加中和剂

盐酸莫西沙星对细菌的抑菌活性较强，检测需氧菌 总数时需要添加合适的中和剂抑制其自身的抗菌活性 ； 白色假丝酵母和黑曲霉的回收率在 0.5 ～ 2.0 之间（表 2）， 符合药典规定要求，表明可直接进行霉菌和酵母菌的微生物限度检测。

3 讨论

不同的产品，或者同一产品用途不同，微生物限度的检测方法都存在差异，需要建立合适的方法。根 据中国药典 2015 版通则 1105 要求，本研究首先确认 了培养基适用性，然后验证计数方法适用性，即微生物 限度检测方法适用性。 盐酸莫西沙星在水中溶解度不是特别好，选择 pH 7.2 磷酸盐缓冲液，可以提高溶解度，并且溶液 pH 稳定。 盐酸莫西沙星配成 1 ∶ 100 的供试液，取 100 ml，采用 薄膜过滤法，单张薄膜菌落数即可为每克原料的微生物 负载量，无需换算，符合检测限度要求的量。 盐酸莫西沙星属于喹诺酮类药物，对金黄色葡萄球 菌、铜绿假单胞菌，枯草芽胞杆菌有明显抑制作用，未 加中和剂或加中和剂聚山梨酯 80 时，这三种细菌的回 收率均为0。