二陈汤加味对慢性阻塞性肺疾病大鼠的影响-DHG

慢性阻塞性肺疾病( COPD) 是一种以不完全可 逆的气流受限为特征的慢性呼吸系统疾病，严重影 响患者的生活质量及寿命。目前，其发病机制仍 不十分清楚，研究发现，吸烟是诱发 COPD 的关键因 素之一，而气管、肺实质与肺血管的炎症反应及结构 重塑是 COPD 的典型病理变化。

1 材料

1. 1 动物

50 只雄性 SD 大鼠，SPF 级，2 月龄，体 质量( 200 ± 20) g，合格证号 SCXK( 鲁) 2014-0007， 由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供; 实验场地 为河南省中医药研究院动物实验中心，许可证号为 SYXK( 豫) 2012-0009，动物实验伦理审查批准编号 DWLL20130018。由江苏省协同医药生物工程有限 责任公司提供动物生长饲料。

1. 2 药物及试剂

二陈汤加味方组成为姜半夏 10 g( 批号 1505001S) ，陈皮 10 g( 批号 1509002S) ，白术 15 g ( 批 号 1407001W) ，茯 苓 20 g ( 批 号 1405002W) ，党参 25 g( 批号 1407007W) ，枳壳 10 g ( 批号 1510002W) ，山药 20 g( 批号 1509003S) ，地龙 10 g( 批号 1511002 S) ，桂枝 3 g( 批号 1510002S) ， 炒苏子 20 g ( 批 号 1512001S) ，炙麻 黄 6 g ( 批 号 1508001S) ，苦杏仁 10 g ( 批号 1404002S) ，葶苈子 15 g( 批号 1506001W) ，均为华润三九医药公司提供 的中药配方颗粒; 脂多糖( LPS，美国 Sigma 公司，批 号 025M40400V) ; 大鼠 IL-4 ELISA 试剂盒，兔抗大 鼠 VEGF 一抗，兔抗大鼠 VEGFＲ2 一抗，DAB 显色 试剂盒( 武汉博士德生物有限公司，批 号 分 别 为 12812591008，13CM409B，12J24，11I18B22) ; 兔多抗 甘油醛-3-磷酸脱氢酶( GAPDH，杭州贤至生物科技 有限公司，批号 AB-P-Ｒ001) ; 小鼠单克隆抗体 ET-1 ( 英国 Abcam 公司，批号 GＲ270664-3) ; 苏木素染色 液，伊红染色液( 北京索莱宝科技有限公司，批号分 别为 G1140，G1100) ; 红旗渠过滤嘴香烟( 河南中烟 工业有限责任公司，烤烟型，焦油含量 14 mg /支，尼 古丁含量 1. 1 mg /支) 。PCＲ 引物序列由北京擎科 新业生物技术有限公司设计合成，见表 1。

1. 3 仪器

DL-5-B 型离心机( 上海安亭科学仪器 厂) ; BA210 型生物显微镜( 北京麦克奥迪实业集团 有限公司) ; BSA124S-CW 型电子天平( 北京麦多利斯仪器有限公司) ; DB-B1 型烤片机( 常州国华电器 有限公司) ; DHP-9050B 型智能型电热恒温培养箱 ( 上海琅实验设备有限公司) ; TP1020-1 型自动组织 脱水处理机，ST5020 型全自动染色机( 上海徕卡显 微系统有限公司) ; SW-CJ-2FD 型洁净工作台( 苏州 安泰空气技术有限公司) ; DYCZ-40 型电转仪( 北京 六一仪器厂) ; QuantStudio 6 型实时荧光定量 PCＲ ( Ｒeal-time PCＲ) 仪( 美国 ABI 公司) ; Nano-100 型 微量分光光度计( 杭州奥盛仪器有限公司) ; JY300 型水平电泳仪( 北京君意东方电泳设备有限公司) ; 精宏DHG -9203A型电热恒温鼓风干燥箱( 上海精宏实验设备有限公司) 。

2 方法

2. 1 分组、模型制备与给药

50 只 SD 大鼠随机分 为 5 组: 正常组、模型组、二陈汤加味低、中、高剂量 组( 10，20，40 g·kg － 1·d － 1 ) 。制备 COPD 大 鼠 模 型，于第 1 天和第 14 天，对除之外的 40 只大鼠 逐一进行麻醉( 腹腔注射 10% 水合氯醛溶液进行麻 醉，给药剂量为 0. 03 mL·kg － 1 ) ，并气管内滴注 LPS ( 1 g·L － 1 ) 0. 2 mL。正常组大鼠气管内注入等量生 理盐水。除第 14 天外，第 2 ～ 30 天将造模大鼠置入 自制的密封烟熏箱内被动吸烟，进行香烟烟雾染毒， 2 次/ d，中间间隔 4 h，香烟 10 支/次，30 min /次。最 终以病理组织及肺功能的改变为标准判断模型是否 制备成功。模型制备成功之后，对各组大鼠进行 灌胃，各组大鼠每日用药分别按照二陈汤加味低、 中、高剂量每日 10，20，40 g·kg － 1换算出免煎颗粒用 量，用纯水稀释后于每天上午 10: 00 及下午 4: 00 分 别灌胃给药。模型组和正常组灌胃相同体积的纯 水，给药全程持续 14 d。灌胃剂量换算，二陈汤加味 中剂量组用药量按照 70 kg 的成年人每日常规服用 药量换算，体表面积系数为 0. 018，确定中剂量后， 低剂量为中剂量的 0. 5 倍，高剂量为中剂量的 2 倍。

2. 2 苏木素-伊红( HE) 染色观察大鼠肺组织病理形态学变化

用浓度为 4% 的多聚甲醛固定大鼠右 肺上叶组织; 选取厚度约 1 ～ 2 cm 的右肺上叶组织 横截面放入包埋盒中，自动组织脱水机脱水; 先在石 蜡包埋机上手动完成石蜡包埋，保存于 4 ℃环境下， 6 μm 厚切片使用自动染色机进行 HE 染色，封片后 光镜下观察大鼠的肺组织结构。

2． 3 测定肺血管壁厚度

每组 HE 染色切片中随 机选取 6 个直径在 200 ～ 350 μm 与呼吸性细支气 管、肺泡管伴行的肺小动脉，并测定其肺血管外径、 管壁厚度、血管总面积及管壁面积，计算出管壁厚度 占外径的百分比( WT% ) 和管壁面积占血管总面积 的百分 比( WA% ) ，以此反映肺小动脉管壁增厚 程度。

2. 4 ELISA 测定 IL-4 含量

于空白孔、标准孔、待 测样品孔中加样并 37 ℃孵育 90 min，弃孔内液体并 甩干，加入抗体工作液并孵育 60 min。弃液并洗板 3 次，每孔加酶结合物工作液 100 μL，37 ℃ 温育 30 min，弃液甩干并洗板 5 次。每 孔 加 显 色 剂 90 μL，酶标板上加覆膜，37 ℃避光孵育 15 min。加 终止液 50 μL 终止反应，在酶标仪 450 nm 波长处检 测各孔吸光度 A。

2. 5 Ｒeal-time PCＲ 检测

ET-1 mＲNA 含量 取新 鲜冰冻组织约 100 mg，加 trizol 试剂，并研磨裂解。 加入三 氯 甲 烷 200 μL，混 匀 后 静 置 5 min。4 ℃ 12 000 r·min － 1，离心 15 min，转 移 上 层 至 1. 5 mL EP 管中，加入异丙醇 400 μL，混匀后静置 10 min。 离心，弃 上 清，加 入 75% 乙 醇 1 mL，混 匀 后 离 心 5 min。弃上清后，于空气中干燥 ＲNA 沉淀，将其溶 于 20 μL DEPC 水中，取溶解后的 ＲNA 2 μL 用微量 分光光度计测定 ＲNA 的纯度和浓度。根据 A 计算 样品 ＲNA 的 浓 度。逆 转 录 成 cDNA，反 应 条 件: 25 ℃ 5 min，50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 10 min。 Ｒeal-time PCＲ 检测，cDNA 做 10 倍稀释，反应条件: 50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min; 95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s， 40 个循环。绘制熔解曲线，最终以 2 － ΔΔCt 表示。

2. 6 免疫组化检测

VEGF，ET-1 及 VEGFＲ2 的表达 将切片脱蜡水化，以双氧水封闭，抗原修复后，滴 入一抗 VEGF，VEGFＲ2，ET-1 工作液，DAB 显色，并 苏木素复染，阳性对照用已知阳性片，阴性对照用 PBS 代替一抗。免疫组化呈现棕黄色为阳性判定依 据。每组切片均随机选取 6 个高倍镜下的视野，使 用图像分析软件 Image-Pro Plus 计算平均积分吸光度 IA，整理数据并进行分析。

2. 7 统计学处理

统计软件采用 SPSS 22. 0 进行 数据分析，符合正态分布，组间比较采用 One-way ANOVA 进行描述，采用 SNK-q 检验法描述组间两 两比较，计量资料采用x珋± s表示; P ＜ 0. 05 为差异有 统计学意义。

3 结果

实验结束时， 正常组大鼠毛皮仍然呈白色并有光泽、呼吸均匀、反 应迅速。模型组大鼠呼吸浅快，呼吸困难，易烦躁激 惹，毛发干燥发黄，精神差。二陈汤加味高、中、低剂 量组分别以相应的药物灌胃后，大鼠体质量增加，二 陈汤加味中剂量组效果最明显。二陈汤加味低剂量 组在动物实验进行期间死亡 1 只，模型组死亡 2 只， 经解剖观察，发现肺气肿及肺部感染可能是致死的 主要原因。镜下观查肺组织，正常组肺泡结构完整，肺血管 管壁无增厚，支气管黏膜结构基本完整，上皮细胞排 列均匀整齐，无变性、坏死，管壁各层无炎性细胞浸 润、无纤维组织增生。模型组细支气管管壁上皮有 多处脱落，黏液下层存在黏液腺增生，管壁各层有大 量炎细胞浸润，管腔内有较多渗出物，部分细支气管周围可见肺大泡，与之伴行的肺血管可见管壁增厚， 局部肺间质增厚，局限性肺不张; 高剂量组肺间质增 厚比较模型组减轻; 与模型组比较，中剂量组病理学 改变较轻，细支气管黏膜破坏较轻浅，上皮变性及坏 死不明显，管腔内渗出物少，肺泡内少量巨噬细胞、 部分肺泡扩张，少量炎细胞浸润，血管管壁增厚不明 显; 低剂量组病理学变化接近模型组。

4 讨论

COPD 可以依据其咳嗽、咯痰、胸闷等临床症 状，而归属于中医“肺胀”“咳嗽”“喘证”等范畴，病 机以肺气虚为本，以痰气交阻于肺为标，本虚标实。 二陈汤作为祛痰剂的代表方，以燥湿化痰，理气和中 的功效著称，方中姜半夏燥湿化痰、和胃降逆，姜制 之后更适于脾虚痰盛及寒痰咳逆; 陈皮理气健脾，茯 苓健脾渗湿以助化痰，甘草健脾和中、润肺止咳、调 和诸药。二陈汤加味方是在二陈汤的药味基础上，再加蜜炙麻黄、炒苦杏仁以宣降肺气、止咳平喘，加 葶苈子以泻肺降逆，加党参、白术、山药以健脾补肺， 寓培土生金之意; 又加干姜温肺祛寒，地龙通络祛 瘀。诸药并用，燥湿化痰、止咳平喘通络，以使肺气 得宣，兼 健 脾 固 肾，以 培 护 根 本。本 课 题 组 基 于 COPD 肺虚痰阻的病机组方，临床应用时常根据患 者肺虚及痰阻的侧重不同而调整方中具体药味用 量，但总以二陈汤为基础进行加减。本次实验中组 方为临床加减变化时的基本方，已在前期做了大量 临床观察证实疗效显著，但其中治疗的作用机制仍 待现代研究证实。