抗血管生成活性研究(精宏DK-600使用)

小檗碱又叫黄连素，是广泛存在于小檗科、毛 莨科、罂粟科、芸香科和防己科等植物中的季铵型 异喹啉类生物碱。药理研究发现小檗碱的作用广 泛，具有抗癌、抗菌、降血糖、调节血脂等多种药理活性，小檗碱作为明星分子，引起了国 内外学者的广泛关注。同时，课题组前期研究发现 小檗碱和其他多种中药活性成分具有影响Ⅳ型胶原 酶活性的作用。鸡胚尿囊膜（CAM）模型作为半 整体动物模型，通过观察给药后对胚胎和新生血管生 成的影响，已广泛用于药物活性和安全性评价。

1 仪器与材料

1.1 仪器

SH-3A 双显恒温加热磁力搅拌器（北京金紫光科技发展有限公司）；RE-52A 型旋转蒸发器（上海 亚荣生化仪器厂）；sartorius BS124S 电子天平（德国赛多利斯股份有限公司）；KQ-500DE 型数控超声 波清洗仪（北京医疗设备二厂）；ZF-I 型三用紫外 分析仪（上海顾村电光仪器厂）；Avance 500 型核磁共振仪；Agilent 1100 Series 高效液相色谱仪；X-5 显微熔点测定仪（北京泰克仪器有限公司）； TU-1810 紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器 有限责任公司）；电热恒温水浴箱-上海精宏DK-600（上海精宏实验设备有限公司）；酶标仪 spectra Max190（美 国 Molecular Devices 公司）；孵化箱（北京方通孵 化器厂）；CJT 型超净工作台（北京昌平长城空气净 化工程公司）；320040 型解剖显微镜（日本 Olympus 公司）。 

1.2 材料

盐酸小檗碱（质量分数 95%）、香草酸（质量 分数 98%）、川芎嗪（质量分数 98%）均购自南京 泽朗医药科技有限公司；水杨酸（质量分数 99%）、 阿魏酸（质量分数 98%）均购自阿拉丁试剂（上海）有限公司；乙酸酐、吡啶均购自北京试剂有限公司； 盐酸四环素，I113003，分析纯，购自阿拉丁试剂（上 海）有限公司；Ⅳ型胶原酶购自北京拜尔迪生物医 药有限公司；二甲基亚砜、石油醚、乙酸乙酯、丙 酮、无水乙醇等化学试剂均为分析纯，购自北京化 工厂。

2 方法与结果

2.1 小檗碱系列衍生物的合成

2.1.1 小檗碱–香草酸（CYQ-40）衍生物的合成

将 香草酸（1 g，5.95 mmol）置于 50 mL 圆底烧瓶中， 加入 30 mL 二氯甲烷后，加入 18 mmol 乙酸酐、少 量吡啶，80 ℃回流搅拌 3 h，石油醚–醋酸乙酯 （10∶7）为展开剂，TLC 监测反应原料基本消失， 停止反应，反应液加入 1% HCl 溶液，洗涤 3 次， 去离子水洗至溶液呈中性，无水 Na2SO4 除水，得 到乙酰香草酸中间体
（1）；将中间体 1 加入二氯亚 砜 10 mmol、二氯甲烷 10 mL，70 ℃回流搅拌 2 h， 回收溶剂至干，乙酰香草酸酰氯中间体
（2）；所得 的中间体 2 取 0.62 mmol 与小檗红碱 0.62 mmol 置 于 50 mL 圆底烧瓶中，加入少量吡啶，室温搅拌 1 h， 抽滤并以石油醚、乙醋酸乙酯、丙酮、氯仿洗涤沉 淀，得到黄色粉末 CYQ-40，产率 92.15%，mp 139.2～140.2 ℃。1 H-NMR（400 MHz，DMSO-d6） δ：7.89（s，1H），6.19（s，2H，O-CH2-O），7.10 （s，1H），3.21（brs，2H），2.51（brs，2H），10.05 （s，1H），8.29（d，1H，J＝9.0 Hz），8.36（d，1H， J＝9.0 Hz），9.12（s，1H），4.01（s，3H，OCH3）， 7.45（dd，1H，J＝8.5、2.0 Hz），7.94（d，1H，J＝ 8.5 Hz），7.85（d，1H，J＝2.0 Hz），3.93（s，3H， OCH3）； 13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：异喹 啉环：111.1，148.6，151.2，111.3，130.7，26.6， 59.0，143.6，115.3，133.8，115.9，112.2，126.2， 135.8，132.0，151.0，120.7，102.3，56.467，161.7， 芳环：139.0，151.4，113.9，127.0，125.6，123.9， 56.0，170.1，19.6。HR-ESI-MS m/z：514.949 3 [M]＋。

2.1.2 小檗碱–水杨酸（CYQ-44）衍生物的合成

将 水杨酸（1 g，7.25 mmol）置于 50 mL 圆底烧瓶中， 加入 30 mL 二氯甲烷后，加入 22 mmol 乙酸酐、少 量吡啶，80 ℃回流搅拌 3 h，石油醚–醋酸乙酯 （10∶7）为展开剂，TLC 监测反应原料基本消失， 停止反应，反应液加入 1% HCl 溶液，洗涤 3 次， 去离子水洗至溶液呈中性，无水 Na2SO4除水，得到水杨酸中间体（3）；将中间体 3 加入二氯亚砜 10 mmol、 二氯甲烷 10 mL，70 ℃回流搅拌 2 h，回收溶剂至 干，乙酰水扬酸酰氯中间体（4）；所得的中间体 4 取 0.62 mmol 与小檗红碱 0.62 mmol 置于 50 mL 圆 底烧瓶中，加入少量吡啶，室温搅拌 1 h，抽滤并以 石油醚、醋酸乙酯、丙酮、氯仿洗涤沉淀，得到浅 黄色粉末 CYQ-44，产率 90.08%，mp 151.1～ 151.9 ℃。1 H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：7.10 （s，1H），6.99（s，1H），3.26（d，2H），1.89（d， 2H），9.66（s，1H），7.15（d，1H），7.24（d，1H），8.88（s，1H），6.19（s，2H，O-CH2-O），4.06（s， 3H，OCH3），8.44（dd，1H），7.57（m，1H），7.85 （m，1H），7.36（dd，1H），2.266（s，3H，COCH3）； 13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：异喹啉环：105.2， 148.6，151.0，108.0，127.0，26.6，56.4，143.6， 120.3，135.3，155.3，111.9，126.2，139.0，130.7， 149.2，120.7，102.3，56.0，162.2，芳环：151.2， 121.8，132.0，125.6，133.8，123.，170.1，19.6。 HR-ESI-MS m/z：485.000 1 [M＋H]＋ 。

3 讨论

基于拼合原理，将明星分子小檗碱与其他一些中药常见的药效小分子进行拼合，得到新 型小檗碱衍生物 4 个，结构均已通过 1 H-NMR、 13C-NMR 和 HR-MS 确证。活性筛选采用课题组前 期建立的Ⅳ型胶原酶抑制剂的筛选模型，经方法学 考察和阳性化合物验证，认为该模型具有一定的可 靠性，可以作为一种药物活性初步筛选的模型方法。 筛选结果表明小檗碱系列衍生物 CYQ-44、CYQ-48 和 CYQ-50 与阳性药盐酸四环素相比，对Ⅳ型胶原 酶有明显的抑制作用，其中 CYQ-48 效果最好，并 呈现出剂量相关性特点。构效关系表明分子内引入 乙酰基和甲氧基，对Ⅳ型胶原酶作用活性可由促进 逆转为抑制作用，如具有乙酰基的 CYQ-44、兼具乙 酰基和甲氧基的 CYQ-40、48。研究结果表明小檗碱 类衍生物 9-位酚羟基可以与苯甲酸衍生物拼合成新 的化学实体，目前获得的衍生物数量偏少，但合成路 线简便可行，希望以后能有更加广泛的系列化合物问 世，对该类化合物的构效关系研究更加深入、透彻， 以期更高效率地获得治疗效果佳的候选药物。



 

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