雷贝拉唑钠细菌内毒素检验方法的建立

雷贝拉唑钠是一种新型的质子泵抑制剂，可于治疗 酸相关性疾病，如消化性溃疡、胃食管反流性疾病、卓 - 艾氏综合征等，具有选择性强烈抑制幽门螺杆菌（Hp） 作用，在临床使用中有显著性优势。注射用雷贝拉唑 钠在生产中控制热原具有其必要性 ，通常采用加活性 炭的方式。但《已上市化学仿制药（注射剂）一致性 评价技术要求（征求意见稿）》中要求注射剂生产中不建 议使用活性炭，为了有效去除热原（细菌内毒素），需加 强对原辅包、生产设备等的控制 。采用的方法有家兔 法测定热原或凝胶法和光度测定法测定细菌内毒素。 由于家兔法更耗时、检验成本更高，故通常采用制定细 菌内毒素限度的方式进行控制。

1 材料和方法

1.1 仪器

N10 试管恒温仪（杭州奥盛仪器有限公司）；XH-D 涡旋混合器（上海允延仪器有限公司）；ML204T 天平［梅 特勒托利多仪器（上海）有限公司］；精宏DHG-9246A 电热 恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）。

1.2 试药

雷贝拉唑钠（珠海润都制药股份有限公司，批号 ： 88817110102、88814080102）；雷 贝 拉 唑 钠（Metrochem API Private Limited，批号：RBS/1508298）；细菌内毒素 工作标准品（湛江安度斯生物有限公司，批号 ：1708160、180101、1806131，效价：10 EU/ 支 ) ；鲎试剂（湛江安 度斯生物有限公司，规格 ：0.1 ml/ 支，标示灵敏度 ：0.25 EU/ml，批号：1703013；标示灵敏度：0.125 EU/ml，批号： 1804161 ；标示灵敏度 ：0.06 EU/ml，批号 ：1803051）；鲎 试剂（福州新北生化工业有限公司，规格 ：0.1 ml/ 支，标 示灵敏度 ：0.25 EU/ml，批号 ：17031712 ；标示灵敏度 ： 0.125 EU/ml，批号 ：18041812 ；标示灵敏度 ：0.06 EU/ml， 批号 ：17091312）；稀释剂Ⅱ（湛江安度斯生物有限公司， 批号：1801220；规格：4.0 ml / 支）；细菌内毒素检查用水（湛 江安度斯生物有限公司，批号：1608010、1804280；规格： 5 ml / 支）。

1.3 方法

取供试品，加细菌内毒素检查用水稀释至浓度为 2C 的供试品储备液与 C 的供试品溶液 ；用细菌内毒素检查 用水将细菌内毒素工作标准品溶解稀释制成浓度为 4λ 的 细菌内毒素工作标准品溶液与浓度为 2λ 的阳性对照溶液 （B）；取 0.5 ml 浓度为 4λ 的细菌内毒素工作标准品溶液 和 0.5 ml 浓度为 2C 的供试品储备液混匀，作为供试品 阳性对照溶液 ；以细菌内毒素检查用水作为阴性对照溶 液。取鲎试剂，用 0.1 ml 细菌内毒素检查用水复溶后， 分别加入 0.1 ml 供试品溶液、阳性对照溶液、供试品阳 性对照溶液、阴性对照溶液，各平行两管，轻轻混匀后， 放入（37±1）℃试管恒温仪中，保温（60±2）min。

2 结果

2.1 细菌内毒素限值的确定

根据其制剂注射用雷贝拉唑钠原研说明书中的用法 用量 ：按静脉输注给药，注射用雷贝拉唑钠规格为 20 mg，使用量为每日 1 瓶，滴注时间在 15~30 min 内。计 算确定雷贝拉唑钠内毒素的限值（L）为 15 EU/mg。 本品为注射用雷贝拉唑钠原料，为保证其制剂的质 量及用药安全，该原料细菌内毒素限值须严于其制剂临 床用药计算的最大限制（15 EU/mg），考虑该制剂生产 工艺、生产用水及其它辅料的带入，故我们将雷贝拉唑 钠内毒素限值（L）1 EU/mg 定为企业标准。

2.2 最低有效稀释浓度的确定

计算公式为 C=λ/L。式中，C 为最低有效稀释浓度 ； λ 为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度 ；L 为供试品的细 菌内毒素限值，以 EU/mg 表示，为 1 EU/mg ；当 λ 为0.25 EU/ml，C=0.25 mg/ml ；λ 为 0.125 EU/ml，C=0.125 mg/ml ；λ 为 0.06 EU/ml，C=0.06 mg/ml。

2.3 鲎试剂灵敏度复核试验

将各灵敏度（λ）的鲎试剂用细菌内毒素检查用水 0.1 ml 复溶，分别加入 2λ、λ、0.5λ 和 0.25λ 四个浓度的 细菌内毒素标准溶液 0.1 ml，每一个浓度平行做 4 管， 另取 2 管加入 0.1 ml 细菌内毒素检查用水作为阴性对照。 当最高浓度为 2λ 管均为阳性，最低浓度 0.25λ 管均为阴 性，阴性对照管均为阴性，试验方为有效。当 λc［λc= lg － 1（∑X/4）］在 0.5λ ～ 2λ 之间时，结果均符合企业标准。

3 讨论

方法筛选过程中发现使用灵敏度为 0.25 EU/ml 的鲎 试剂检测时，其最高不干扰浓度为 0.25 mg/ml，与其最 低有效稀释浓度一致，故采用最低有效稀释浓度检测时， 存在 PPC 管呈阴性的风险。由于其溶液 pH 不在 6.0 ～ 8.0 这一适宜 pH 范围内，考虑使用稀释剂Ⅱ作为稀释剂， 将 pH 调节至该范围内，但干扰情况未得到改善，且发 现使用该稀释剂雷贝拉唑钠溶解度变差，故仍以细菌内 毒素检查用水为溶剂为宜。为减小供试品溶液检测浓度， 考虑使用小灵敏度的鲎试剂检验，为保证其 2C 浓度下 无干扰，故选择灵敏度为 0.06 EU/ml 的鲎试剂。

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