电热恒温培养箱的激动剂筛选体系建立

材料与仪器

Sigma 3K15 台 式 高 速 低 温 离 心 机（ 美 国 Sigma 公司）；恒温摇床（上海精龙跃仪器设备有 限公司）；电热恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）；超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物 科技股份有限公司）；PowerPacTMBasic 电泳仪， T100TMThermal Cycler PCR 仪（美国伯乐公司）； Spectra M5 多功能连续光谱酶标仪（美国分子仪 器公司）；Tanon-4100 全自动凝胶成像分析系统（上 海天能科技有限公司）；Biacore T200 生物大分子 互作仪（美国通用公司）。GK-pCMV6-entry（Origene）、pET28a（本实 验室 −80 ℃保存）

实验方法

将测序正确的融合蛋白质粒转入大肠杆菌表 达菌株 BL21（DE3），平板涂布于含 0.1 mol·L−1 卡那霉素的固体 LB 培养板上，于 37 ℃培养箱中 倒置培养过夜。次日挑取单菌落摇菌至浑浊，后 按 1 ∶ 100 的比例转接进新的 LB 液体培养基并于 37 ℃振摇培养箱中振摇培养（150~170 r·min−1）， 菌液 OD600 至 0.6 左右分别加入不同浓度 IPTG， 孵育不同时间，低温收集菌体并超声破碎取上清， 利用 SDS-PAGE 蛋白电泳分析不同诱导条件下蛋 白的表达情况以确定最佳诱导表达条件。首先是蛋白的预富集， 将蛋白用 pH 4.5、5.0、5.5 的醋酸钠分别稀释到 10 μg·mL−1，通过预富集实验确定 pH 5.0 为最佳 偶联条件。芯片用 0.4 mol·L−1 EDC 和 0.1 mol·L−1 NHS 按体积比 1 ∶ 1 混 合 活 化， 用 pH 5.0 的 醋酸钠将蛋白稀释至 10 μg·mL−1 进 行 偶 联， 以 1 mol·L−1 乙醇胺（pH 8.5）封闭活化的芯片表面。 受试化合物用 PBST 缓冲液稀释到 50、25、12.5、 6.25、3.125、1.562 5 μmol·L−1 后放入仪器。实验 结果用自带数据分析软件 Biacore T200 Evaluation Software 分析。

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