上海精宏浅谈病原菌鉴定与抑菌实验

锦带花是城市园林中常见的绿化美化树种，是大连园林主 栽树种。研究表明，锦带花可以净化空气，吸收粉尘、大气污 染物，提高市区的空气质量。锦带花还具有极高观赏价值， 枝叶茂密，花色艳丽，花期长，其对氯化氢抗性强，是良好的 抗污树种，具有较高的美化和环保价值。同时，锦带花还 具有一定的药用价值，可用于治疗瘟病初期、头痛咽干、喉 痹、痈肿疔疮、丹毒等症。近些年来，大连市区锦带花染 上了较为严重的叶斑病，轻者可使树木提前落叶，严重可导致 整株死亡。因此，查明其发病病因，为其病害防治提供理论依 据已成为当务之急。

一、材料与方法

(一)实验材料 锦带花叶斑病叶片和健康叶片为实验材料。

(二)研究方法

1.病害调查、症状观察与采样 在有锦带花发病区的地段，我们随机采取感病植株的感病 叶片50片，装入塑料袋中备用(供分离纯化病原菌用)。在自然条 件下，观察病害症状特点，如有无明显的病征，外部病变等。
2.病原菌的分离与纯化 本实验采用单斑分离法，在病健交界处剪取约4mm2 的 病组织数块，经酒精消毒，放置培养基中，在28℃恒温箱 培养3～4天，计算真菌分离率。我们挑取单个分生孢子， 进行单孢纯化。
3.分离菌致病性检测 依据科赫法则检测。
4.病原菌鉴定
1)病原菌的形态学鉴定：我们用肉眼观察菌落正、反面颜 色及是否有轮纹等；显微镜下观察分生孢子形态，记录产孢时 间。依据菌株形态特征，初步鉴定分离菌的种类。
2)病原菌的分子生物学鉴定：利用真菌通 用引物ITS1和ITS4。其引物序列：ITS1(5’- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)。我们用MEGA5.0软 件进行序列分析，邻近法构建分子系统发育树。
5.农药抑菌试验
1)农药培养基配置：我们将农药代森锰锌、百菌灵和苯 醚甲环唑分别配成浓浓为80μg/L、150μg/L、220μg/L、 290μg/L、360μg/L的培养基做为实验组；对照组加等量的 无菌水。
2)接种菌饼：我们将菌饼接种于混有药剂和无菌水的PDA 平板中央进行编号，然后转移至28℃恒温培养箱(上海精宏DNP-9272电热恒温培养箱)中，培养4 天，测量菌落直径，计算抑菌率。

二、结果与分析

主要发病部位为叶片，其他部位未见发病。叶片发病初 期，染病部位褪绿变黄，逐渐形成枯斑，无规律地分布在叶片 上，随着病情加重，可导致穿孔最后叶片逐渐枯死。(图1)

(二)单斑分离率 我们采用单斑分离法，从发病的锦带花感病组织中分离出2 株真菌，分别命名为A2和B1。其单斑分离率各为67%、30%。其 中，菌株A2的分离率较高，我们初步认为是该叶斑病的致病菌。
(三)分离菌株的致病性检测 将分离出的两株真菌接种至健康叶片后，A2可使健康的 锦带花叶片发病，发病率为100%；接种B1未见发病。对接种 发病叶片进行单斑分离鉴定，我们在显微镜下观察可见，分离 菌与接种菌的菌落形态一致。由此可断定：A2为锦带花叶斑 病的致病菌(见图2)。

三、讨论

我国园林植物种类繁多，其植物病害的种类也十分复杂。园 林植物在自然生长过程中，极易受到各种病原微生物的侵染。其 中主要以真菌性病害为主，而叶斑病是影响植株美观和品质较为 严重的病害。在锦带花大面积种植的背景下，查明其叶斑病的 病原菌，找到一种经济高效的抑制或治疗锦带花叶斑病的方法显 得尤为重要。本实验采用植物病理学研究法，对大连市锦带花叶 斑病病原菌进行了形态学和分子生物学鉴定，结果显示病原菌为 链格孢属(Alternaria)的链格孢菌(Alternaria alternata)。



 

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