分析衰老模型小鼠的抗氧化作用

桑黄是担子菌门 (Basidiomyco- tas) 层菌纲 (Hymenomycetes)非褶菌目(Aphyllopho- rales)锈革 孔菌科(Hymenochaetaceae)针层孔菌属(Phellinus Quel.)的一类药用真菌，由于此种菌类大多生长在 桑属(Morus L.)植物上，且子实体为黄褐色而得名。 传统中医中，桑黄多用于治疗血崩、血淋、脐腹 涩痛、脱肛泻血、带下、闭经等妇科疾病，现代 药理研究表明其具有抗氧化、抗肿瘤、免疫、保 肝等功效。虽然报道中所用桑黄菌种存在差异， 但整体上看，不同菌种桑黄所产化合物类型比较 接近，相关药效也类似。据报道桑黄粗多糖、 包外多糖、包内多糖及分级纯化多糖均能增强机 体对自由基损伤的防御机能，有效减轻脂质过氧 化物对组织或细胞的损伤。

1 材料和试剂

1.1 动物

ICR 小鼠，清洁级，♂，体质量 18~22 g，购 自浙江省实验动物中心，生产许可证号为 SCXK( 浙 )2014-0001 ，动物合格证号为 1712120005，1712190008。动物饲养条件：屏障 系统内饲养，温度 18~28 ℃，湿度 60%~80%，12 h 明暗交替。饲料来源于浙江省实验动物中心。

1.2 药物及试剂

桑黄 Inonotus sanghuang：“浙黄 1 号”菌种产 品，黄褐色疏松块状或颗粒，批号为 20180716， 由淳安千岛湖桑都食用菌专业合作社提供，经浙 江省食品药品检验研究院中药所俞建平副主任药 师鉴定为合格药材；维生素 E(浙江医药制药有限 公司新昌制药厂，批号：170837)；D-半乳糖(Sigma 公司，批号：785R1305J；纯度：98%)；总抗氧化 能力(T-AOC)试剂盒(批号：20171130)、总超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(批号：20171121)、总蛋白 定量试剂盒(批号：20171121)、丙二醛(MDA)试剂 盒 ( 批号： 20171120) 、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-PX)试剂盒(批号：20171117)、过氧化酶(POD) 试剂盒(批号：20171212)、还原性谷胱甘肽(GSH) 试剂盒(批号：20180109)均购于南京建成生物工程 研究所；Nrf2 抗体(ab62352)、HO-1 抗体(ab13243) 均购于美国 abcam 公司；β-Actin(4970s)、Ig G-HRP 标记二抗(7074S)均购于美国 CST 公司。

1.3 仪器

AEL-200 电子天平 ( 日本岛津公司 ) ；上海精宏DKZ-2B电热恒温振荡水槽；Microfuge16 离心机(美国贝克曼公司)； Synergy-2 SLFPA 全波长多功能酶标仪(美国伯腾 公司)；Western blot 转膜仪(美国 Bio-Rad 公司)。

2 方法

将桑黄粉碎，称量，加 8 倍量水，浸泡 0.5 h， 煎煮 1 h，滤过，滤渣加 6 倍量水，煎煮 0.5 h，滤 过，滤渣再加 5 倍量水，煎煮 0.5 h，滤过，合并 滤液，浓缩至生药含量 2 g·mL1 的桑黄水煎液。 将桑黄水煎液置于 4~8 ℃环境，冷藏保存，备用。40 只 ICR 小鼠随机分为正常对照组和桑黄 高、中、低剂量组(12，6，2 g·kg1 )，每组 10 只， 按 20 mL·kg1 体质量灌胃，每天 1 次，连续给药 15 d，末次给药 1 h 后，取血测定血清 SOD 活力 以及 MDA 含量，取肝脏、肾脏，称重并计算脏器 指数。取部分肝脏制备肝匀浆，采用蛋白定量试 剂盒测定肝匀浆的蛋白浓度，并按照试剂盒说明 书检测肝组织中 T-AOC、MDA、SOD 和 GSH-PX 的活力。提取小鼠肝组织蛋白，根据 BCA 试剂盒说明 书测定蛋白质量浓度。取 20 μg 蛋白，在 10%的 SDS/PAGE 中以 80 V 电压电泳。200 mA 低温条件 下转膜，转膜后在 5%的脱脂奶粉封闭液中常温封 闭 1 h。HO-1(1∶1 000)、Nrf2(1∶1 000)和 β-Actin (1∶1000)抗体 4 ℃孵育过夜。洗膜后，相应的二 抗(1∶3 000)常温摇床孵育 2 h。用 ECL 试剂，凝 胶成像系统进行图像采集。

3 结果与分析

桑黄各剂量组小鼠体质量和肝脏及肾脏系数 与正常对照组相比均无明显差异。桑黄各剂量组血清中 SOD 酶活力 均与模型组、正常对照组无明显差异，故未在表 中展示。与正常对照组相比，模型组血清中 MDA 和 GSH 显著升高(P<0.01)，T-AOC 显著降低 (P<0.05)。与模型组相比，桑黄各剂量组 MDA 含 量和 GSH 均显著降低(P<0.01)，T-AOC 水平显著 升高(P<0.01，P<0.05)。与正常对照组相比，模型组T-AOC、SOD 和 POD 酶活力呈下降趋势，GSH 水 平有升高趋势，但差异均无统计学意义；桑黄低、 中剂量组 POD 酶活力较正常组明显上升(P<0.01)， 桑黄高剂量组 SOD 酶活力降低(P<0.05)。与模型 组相比，桑黄各剂量组 GSH 水平无统计差异，而 POD 酶活力显著升高(P<0.01，P<0.05)，桑黄中剂 量组 T-AOC 水平略有上升，SOD 酶活力显著升高 (P<0.05)

4 讨论

对 4 种桑黄不同组分进行体外总 抗氧化能力测定，揭示桑黄水溶性组分活性较好， 故本实验采用桑黄水煎液进行体内抗氧化试验。 在一定时间内连续注射 D-半乳糖是小鼠衰老模型 的经典方法，MDA 是脂质过氧化的产物，其 MDA含量高低间接反应了机体细胞受自由基攻击 的严重程度；SOD 能清除超氧阴离子自由基，保 护细胞免受损伤；GSH-PX 是机体内一种催化过氧 化氢分解的酶，其特异地催化 GSH 对过氧化氢的 还原反应，可保护细胞膜结构和功能完整的作用； POD 协同 SOD 和 GSH-PX 一起分解体内自由基代 谢产物；T-AOC 可反映机体内总体的抗氧化水平， 故本实验选择这几项指标。



 

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