上海精宏检测奶牛血清中脂肪酸浓度

奶牛分娩前 2 周至分娩后 10 d，其血浆中脂肪酸 浓度从平均 0. 2 mmol /L 增高至平均 0. 75 mmol /L， 患酮病的奶牛可达到 1 mmol /L 。脂肪酸代谢紊乱 不仅引起胰岛素抵抗，而且影响细胞免疫。较 早的脂肪酸检测方法常用气相色谱法 ( GC)。由 于检测温度高，不饱和脂肪酸在检测过程中易发生异 构化，近年来开始应用条件温和的高效液相色谱法 ( HPLC) 对人体血清、血浆或红细胞膜脂肪酸浓度 进行检测。HPLC 分析奶牛血清中脂肪酸浓度的 方法尚未见报道。本文建立 HPLC 检测奶牛血清中脂肪酸浓度的方法，可用于奶牛脂肪酸代谢的相关 研究。

1 材料与方法

1. 1 试验动物

北京农业职业学院教学牧场临床健康奶牛。

1. 2 试剂

对照品: 二十碳五烯酸 ( C20 ∶ 5，EPA，纯度≥ 99%) 、豆蔻酸 ( C14 ∶ 0，纯度≥99%) 、二十二碳 六烯酸 ( C22 ∶ 6，DHA，纯度≥99%) 、花生四烯酸 ( C20 ∶ 4，AA，纯度≥99%) 、亚油酸 ( C18 ∶ 2，纯 度≥99%) 、棕榈酸 ( C16 ∶ 0，纯度≥99%) 、油酸 ( C18 ∶ 1，纯度≥99%) 、正－十七烷酸 ( C17 ∶ 0，纯 度≥99%) 、硬脂酸 ( C18 ∶ 0，纯度≥99%) 、2－溴 苯乙酮 ( 分析纯) 均购自北京雪杰特科技有限公司; 正庚烷 ( 分析纯) 、冰醋酸 ( 分析纯) 、甲醇 ( 色谱纯) 、乙腈 ( 色谱纯) ，均购自国药集团化学试剂有 限公司; 三乙胺 ( 分析纯) 、磷酸 ( 分析纯) 、丙酮 ( 分析纯) ，均购自北京化工厂。

1. 3 试剂配制

内标溶液: 称取 C17 ∶ 0 约 12 mg，精密称定， 置 10 mL 容量瓶中，用正庚烷溶解定容。对照品储备 溶 液: 分 别 取 适 量 C20 ∶ 5、C14 ∶ 0、C22 ∶ 6、 C20 ∶ 4、C18 ∶ 2、C16 ∶ 0、C18 ∶ 1、C18 ∶ 0，精密 称定，置不同容量瓶中，分别加正庚烷稀释制成每 1 mL 约含 2. 8 mg 的单脂肪酸对照品储备溶液。对照品 工作溶液: 精密量取 C20 ∶ 5 对照品储备溶液 0. 13 mL、C14 ∶ 0 对照品储备溶液 0. 05 mL、C22 ∶ 6 对照 品储备溶液 0. 13 mL、C20 ∶ 4 对照品储备溶液 0. 02 mL、C18 ∶ 2 对照品储备溶液 0. 13 mL、C16 ∶ 0 对照 品储备溶液 0. 1 mL、C18 ∶ 1 对照品储备溶液 0. 2 mL、C18 ∶ 0 对照品储备溶液 2 mL，置 25 mL 容量瓶 中，用正庚烷定容。2 mol /L 磷酸: 量取磷酸 0. 136 mL，加入适量纯化水中，定容至 10 mL，即得。提取 液: 异丙醇－正庚烷－2 mol /L 磷酸 ( 80 ∶ 20 ∶ 2) 。20 mg /mL 2－溴苯乙酮丙酮溶液: 称取 0. 20 g 2－溴苯乙 酮置 10 mL 容量瓶中，用丙酮定容，即得。25 mg / mL 三乙胺丙酮溶液: 称取 0. 25 g 三乙胺置 10 mL 容 量瓶中，用丙酮定容，即得。10 mg /mL 醋酸丙酮溶 液: 称取 0. 1 g 醋酸置 10 mL 容量瓶中，用丙酮定容 至刻度，即得。

1. 4 血浆脂肪酸提取

取 0. 25 mL 血清于 10 mL 离心管中，加入 25 μL 内标溶液和 1. 25 mL 提取液， 旋涡 10 min，随后加入 1 mL 正庚烷和 0. 75 mL 水， 涡旋 5 min，以 4 500 r/min 离心 5 min，取上层正庚 烷溶液，置 4 mL 玻璃瓶中，离心管再加入 1 mL 正庚 烷，涡旋 5 min，以 4 500 r/min 离心 5 min，合并上 层正庚烷溶液，氮气吹干，得样品小瓶。

1. 5 标准曲线的制备

分别精密量取对照品工作溶液 50、100、200、 400、800 μL，置 4 mL 玻璃瓶中，分别加入 25 μL 内 标溶液，氮气吹干，得标准曲线小瓶。

1. 6 脂肪酸的衍生化

取样品小瓶或标准曲线小瓶，加入 2－溴苯乙酮 丙酮溶液 5 0 μL 及三乙胺溶液 50 μL，加入丙酮 300 μL，盖紧螺旋盖，震荡 1 min，置 95 ℃ 干燥箱(上海精宏DHG-9247A)中反 应 15 min，取出冷却，加入 75 μL 醋酸丙酮溶液，震 荡 1 min，置 95 ℃ 干燥箱中反应 5 min，取出冷却， 氮气吹干，0. 5 mL 甲醇复溶，过微孔滤膜，置 1. 5 mL 上机小瓶中。

1. 7 色谱条件

色谱柱 Inert Sustain C18 ( 150 mm × 2. 1 mm，3 μm) 。流动相: A 液为乙腈，B 液为甲醇－水 ( 50 ∶ 50) ，0～30 min 乙腈的浓度为 52%，30～50 min 乙腈 的浓度从 52%升至 79%，50 ～ 60 min 乙腈的浓度从 79%升至 85%，60 ～ 65 min 乙腈的浓度从 85%升至 100%，保持 5 min，乙腈的浓度恢复 52%，平衡 20 min。流速: 0. 45 mL /min，检测波长: 244 nm，柱 温: 50 ℃。进样体积: 10 μL。按内标标准曲线计算 血清中脂肪酸含量。

1. 8 精密度试验

精密量取 0. 25 mL 血清，按照 1. 4、1. 6、1. 7 方 法，平行做 5 次，由计算各脂肪酸浓度，计算相对标 准偏差 ( ＲSD) 。 1. 9 加样回收率试验 精密量取 0. 25 mL 血清，加入 100 μL 对照品工 作溶液，混匀，按照 1. 4、1. 6 、1. 7 方法，平行做 3 次，由标准曲线方程计算各脂肪酸浓度，计算回收率。

2 结果与分析

脂肪酸混合标准品色谱和奶牛血清样品色谱见图 1。脂肪酸混合标准品色谱图中，8 种脂肪酸全部达 到基线分离。奶牛血清样品色谱图中，在 25. 694、 32. 050 min 存在 2 个未定义峰 ( 图 1B 箭头处) ，推 测可能分别是正 － 十二烷酸 ( C12 ∶ 0) 和亚麻酸 ( C18 ∶ 3) 。奶牛血清中，二十二碳六烯酸 ( C22 ∶ 6) 未检出。

3 讨论

脂肪酸没有紫外吸收，使用紫外检测器进行检测要进行衍生化反应。采用 2－溴苯乙酮作为衍生化 试剂，操作简单方便，衍生化后产物稳定，在 60 min 内即可完全出峰。乙腈、丙酮和正己烷均是良好的衍 生化反应介质，水的存在将会导致反应得率的降低， 本试验采用干燥箱加热的方法进行衍生化反应。 Wood 等曾指出，过量的 2－溴苯乙酮可能会与 色谱柱内的填料发生作用，或与其他任何富集于柱上 的带羧基的化合物发生反应而干扰色谱峰的检测。因 此，衍生化后加入过量醋酸来破坏过剩的衍生剂是试 验成功的关键之一。