利用TALEN技术构建猪内源性基因Tiki1打靶猪模型

体细胞核移植技术在农业家畜育种和人类 (Homo sapiens)疾病动物模型的建立等领域具有重 要的价值。小鼠（Mus musculus)器官大小和各项生 理指标均与人类相差较大，无法准确的模拟人类的 生长发育和疾病发生发展过程。非人灵长类动物 与人类无论是进化角度还是具体生理指标等在各 个方面都极为相似，但是其资源匮乏，饲养费用昂 贵，再加上伦理道德问题，极大限制了非人灵长类 在科学研究中的应用。选择猪(Sus scrofa)作为转基 因动物模型，能更有效地模拟人类的生长、发育和 疾 病 发 生 等 生 理 病 理 过 程 (Robert, 2005; Houdebine, 2009; Herreros-Villanueva et al., 2012)。

1 材料与方法

1.1 材料

分子实验相关试剂无特殊说明均购自TaKaRa 公司（大连)，化学试剂无特殊说明均购自Sigma公 司（美国)，细胞培养相关试剂无特殊说明均为Gibco（美国)。实验猪（Sus scrofa)来自中国科学院广州 生物医药与健康研究院医用猪大动物基地，所用细 胞由中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良 学实验室分离冻存。所用猪卵从广州市屠宰场取 回后由本实验室体外培养成熟。

1.2 实验方法

1.2.1 TALEN构建和体外活性检测

1.2.1.1 TALEN设计及构建

根据 Tiki1 基因外显子 4 设计 1 对 TALEN 质 粒，TALEN 质粒的组装和活性检测交由北京唯尚 立德生物公司完成。

1.2.1.2 TALEN体外活性检测

体外检测TALEN活性采用的是单链复性（single-strand annealing, SSA)方法，通过检测荧光素酶 活性，预测TALEN的切割活性，重复3次。

1.2.2 TALEN质粒体外转录

按照试剂盒 mMESSAGE SP6（Ambion, 美国) 和大肠杆菌(Escherichia coli) Poly（A) Polymerase （NEB, 美国)的操作步骤进行。

1.2.3 孤雌激活胚的制备

将成熟卵母细胞放入融合液，进行平衡，将平 衡好的胚胎移入融合槽内，进行电脉冲刺激。胚胎 融合的同时激活。

1.2.4 TALEN mRNA胞质注射

用 显 微 操 作 系 统 注 射 针 将 1~2 pL TALEN mRNA 注射进胚胎细胞质，并放入猪合子培养液 (porcine zygote medium-3, PZM-3)中置于培养箱（上海精宏试验设备提供）。 胚胎培养7 d后统计囊胚率。

1.2.5 体外胚胎鉴定

根据猪Tiki1基因序列及设计的质粒的打靶序 列，用PCR方法进行扩增及测序鉴定。引物序列：F：5' -CTGCTGAGCTACCAGGGAAC-3'；R：5' -ATGTCCTGGAGGTTCTCACC - 3'。 PCR 反 应 体 系 (25 μL)：2×Premix Tag 12.5 μL，10 μmol/L 上、下游 引物分别为 0.5 μL，DNA 模板 1 μL，ddH2O 10.5 μL。反应条件为：95 ℃预变性 5 min；95 ℃变性30 s，59 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共 35 个循环； 72 ℃ 7 min；4 ℃保存。

1.2.6 细胞转染筛选及鉴定

1.2.6.1 转染

取约 1×107 个细胞，转入电转杯中，加入 TALEN质粒与pcDNA 3.1质粒各50 μg，经电转仪共转 染 猪 胎 儿 成 纤 维 细 胞 (porcine fetal fibroblasts, PFFs）。

1.2.6.2 筛选

电转后细胞分装到15个10 cm培养皿中，隔天 换为含遗传霉素(geneticin, G418)的细胞培养基，筛 选8~10 d后，挑取细胞克隆。

1.2.6.3 细胞克隆的PCR鉴定

细胞克隆采用 PCR 产物测序鉴定方法(同 1.2.5)。PCR产物送深圳华大基因测序。 

2 结果与分析

根据哈佛大学儿童医学院贺熹教授团队提供的人 Tiki1 基因的完整的 cDNA 序列(Zhang et al., 2012)，在猪的基因组数据库里比对，发现预测的猪 Tiki1基因位于第3号染色体上，其预测的外显子4 序列与人 Tiki1 基因的同源性最高，因此在预测的 猪 Tiki1 基因外显子 4 设计 1 对 TALEN (TALEN-L 和TALEN-R)，具体序列。把体外转录的 TALEN mRNA 分别以 0、4、20 和100 ng/µL注射到猪的孤雌激活胚中，体外培养 到囊胚，检测囊胚率和打靶效率。对照组注射等体 积的 H2O 内含 0 ng/µL TALEN mRNA，注射 135 个 猪孤雌激活胚后共计获得囊胚 58 个，囊胚发育率 为42.9% (58/135)；当注射的TALEN mRNA为4 ng/ µL浓度时，注射160个猪孤雌激活胚后共计获得囊 胚 44 个，囊胚发育率为 27.5% (44/160)；当注射的 TALEN mRNA 为 20 ng/µL 浓度时，注射 160 个猪 孤雌激活胚后共计获得囊胚 47 个，囊胚发育率为 29.4% (47/160)；当注射的TALEN mRNA为100 ng/ µL浓度时，注射160个猪孤雌激活胚后共计获得囊 胚32个，囊胚发育率为20.0% (32/160)(表1)。以上 结果说明，随着TALEN mRNA注射的浓度的增大， 对猪孤雌胚的发育影响较小。

3 讨论

Tiki1基因是哈佛大学儿童医学院贺熹教授实验室发现的一个对蛙头部的诱导起到决定性作用 的新基因(Zhang et al., 2012)，近年来 Tiki1 基因作 为 Wnt 信号通路中新的抑制因子(Zhang et al., 2016a; Zhang, He, 2016)进入了人们的视野,但Tiki1 在小鼠等啮齿类动物中缺失(Bazan JF et al., 2013)， 因而无法利用啮齿类动物模型研究Tiki1基因在哺 乳动物发育过程中的作用。而且小鼠等啮齿类实 验动物模型在器官大小、解剖结构等各方面均与人 类有很大差异，现已建立的小鼠疾病模型大多只能 模拟人类疾病的部分症状，阻碍了对人类疾病的发 病机理和治疗方法的研究(Vodicka et al., 2005)。