羊肚菌毛细管电泳指纹图谱的研究

羊肚菌(Morchella)是一种野生珍贵菌,由于 其菌盖表面凹凸不平,状如羊肚,故名羊肚菌｡羊 肚菌为羊肚菌科盘菌目珍稀的食药两用真菌｡羊 肚菌肉质脆嫩,风味独特,味道鲜美,营养和药用 价值极高｡羊肚菌既是宴会上的佳肴,又 是久负盛名的良药,曾经作为珍惜贡品献给皇帝享 用｡在我国,有关羊肚菌的药用记载始于李时珍 的《本草纲目》“甘寒无毒､益肠胃､化氮理气”｡ 如今羊肚菌已经成为欧洲国家著名的高级食材, 含有丰富的蛋白质､多种维生素及 20 多 种氨基 酸,味道鲜美,营养丰富｡它与冬虫夏草功能相同, 是一种不含任何激素､无任何副作用的天然滋补 品｡羊 肚 菌 春 末 至 秋 初 生 长 于 海 拔 2000~ 3000m的针叶阔叶混交林中,在云南､四川､西 藏､贵州､辽宁等地有分布。

该研究通过利用高效毛细管电泳建立不同来 源的羊肚菌进行指纹图谱,并结合相似度评价､聚 类分析及主成分分析等方法对8种羊肚菌样品进 行相关分类,以期为全面评价羊肚菌提供有效方 法和科学依据。

供试羊肚菌菌种保存于辽宁省农业科学院食用菌研究所;主要来源于辽宁､武 汉和四川 (表1),Na2B4O7､H3BO3､Na2HPO4､NaH2PO4 (美国amresco生物试剂公司);试验过程用的试 剂均为分析纯和色谱纯;试验用水为超纯水。

供试仪器:P/ACE MDQ 毛细管电泳仪(美国贝克曼公司);精密 pH 计(北京泰亚赛福科技发展有限责任公司);电子天平(赛多利斯);超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司);HZQ-QX 全温振荡器(哈尔滨市东联电 子技术开发有限公司);干热消毒箱(上海精宏实验设备有限公司);A11高速粉碎机(德国IKA 集 团);CascadaTM实验室超纯水系统(Pallcorporation) 微孔滤膜(孔径0.22μm,津隆设备有限公司)。

将实验室保存的羊肚菌活化接种于马铃薯液 体培养基中,25 ℃,180r·min-1摇床培养7d｡ 将发酵 液 过 滤 后,用 无 菌 水 冲 洗 菌 丝 体 3 次, 60 ℃烘干,粉碎,过100目筛｡得到的菌粉按照 1∶30加水,超声30min,95 ℃水浴锅保温4h,过 滤后取上清液｡将处理好的产物用0.22μm 孔 径的水系滤膜过滤,收集续滤液加同体积的运行 缓冲液作为样品溶液。

电泳操作条件如下:未涂层石英毛细管(50μm×48cm);运行缓冲液10mmol·L-1硼 砂缓冲液(pH9.21);10mmol·L-1硼酸缓冲液; 检测波长214nm;分离电压20kV;温度 25 ℃;压力0.5psi进样10s,运行时间为30min｡毛细 管柱用前依次用0.1mol·L-1NaOH 溶液､水､ 运行缓冲液分别冲洗10min,进样前用运行缓冲 液冲洗5min。

方法的精密度:取羊肚菌 LNY4菌粉溶液用 缓冲液配置成0.05mg·mL-1(按照上述色谱条 件)连续进样测定5次,记录迁移时间和峰面积, 计算迁移时间相对标准差(RSD)和峰面积的相对 标准差 (RSD)均 小 于 3%,表 明 仪 器 的 精 密 度 良好｡ 稳定性的测定:将羊肚菌 LNY4菌粉提取好 的样品(按照上述的方法制得),分别在室温下放 置0､2､4､6､8h后(按照上述的色谱条件)分别进 样,计算得各共有峰相对保留时间的 RSD<1%, 相对峰面积的 RSD<3%,表明样品在8h内各成 分稳定｡ 重现性试验:取羊肚菌 LNY4菌粉(按照上 述的方法制得),同法制备7 个供试品进行检测, 记录和计算各峰相对保留时间和相对峰面积的 RSD均小于3%,表明该方法的重现性好｡ 方法准确性验证:为验证该研究的可靠性和 准确性,将8种羊肚菌样品进行 DNA 的提取,并 建立 分 子 系 统 发 育 树｡2 条 PCR 引 物 分 别 为 ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和 ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)｡ PCR扩增反应程序为95 ℃ 预变性4min,95 ℃ 变性30s,57℃退火30s,72℃延伸60s,30个循 环,72 ℃延伸7min｡ 1.3 数据分析 对获得的8种羊肚菌指纹图谱采用 Excel和 SPSS软件中的相似度评价､聚类分析和主成分 分析等方法进行分析或作图｡为确定羊肚菌毛细 管电 泳 图 谱 的 特 征 峰 和 共 有 指 纹 图 谱;利 用 Mega7.0软件的 NJ法建立8种羊肚菌的分子系 统发育树。

制定指纹图谱标准常使用参比物,以确定图谱中参照峰的位置和丰度｡一般情况下参比 物选取容易获取一个或一个以上的主要活性物 质,主要用于考察指纹图谱的稳定程度和重现性, 该研究选取了重现率为100%,且分别在8个样 品中峰面积最高占比为19.82%~29.06%的10 号峰为参比物。

一个品种的指纹图谱是由各个具有指纹意义的峰组成的完整图谱构成,各个有指纹意义的峰 的位置(保留时间)､大小或高低(相对面积或峰 高)､各峰之间相对的比例是指纹图谱的综合参数｡供试品与对照样品之间的相对峰面积积分相 差20%以上的,说明样品含有的内在物质有较为 明显“量”的差异｡在相同色谱条件下对8种羊肚 菌样品进行测试,以 10号峰为参照峰,计算其它 各峰 的 相 对 保 留 时 间 (表 2)和相对峰面积。

为选取适当的检测波长,采用二极管检测器 对样品溶液在波长为190~300nm 范围内进行 扫描,发现样品在214nm 处能够同时出峰且分 离效果较好,故选取此波长作为检测波长｡试验 常用的磷酸盐､硼砂等缓冲体系对样品及对照品 的分离进行考察,以 选 取 合 适 的 缓 冲 体 系｡ 通 过磷酸盐 缓 冲 液 不 同 的 pH,确 定 分 离 样 品 的 最适 分 离 pH,通 过 试 验 比 较 发 现,用 pH 为 9.21的磷酸盐溶液分离时,样品的分离效果较 好,故选择碱性缓 冲 液 硼 砂 溶 液 进 一 步 进 行 优化｡选择 10､20､50､75mmol·L-1硼砂缓冲液 对样品进行分离｡结果发现当硼砂缓冲液浓度达 到10mmol·L-1时,样品和对照品的分离效果最 佳,分离度和峰形都达到了相对最好的情况,故选 10mmol·L-1及pH 为9.21的硼砂,10mmol·L-1 硼酸缓冲液缓冲体系作为最终运行缓冲液｡并在 此条件下进行波长优化及电压优化｡在优化分离 电压时,比较分析15､20､30kV3个不同电压下 样品的迁移与分离情况,发现在15kV 时,基线 不好,30kV 时出峰延迟,峰形拖尾,故最终选择 20kV 作为电泳测定的运行电压。