蜈蚣藻多糖生物活性研究-精宏水浴锅的使用！

0 引言

蜈蚣藻是大型红藻，生长在低潮线，中国沿海地区 均有分布，可以进行规模化的人工养殖。蜈蚣藻多糖 是一种硫酸酯多糖，具有抗肿瘤、抗病毒、抗凝血 、 降血脂、降血糖 、抗疲劳等众多生物活性。益生元是指不被宿主消化吸收却能有选择性地促进其体内双 歧杆菌等有益菌的生长和繁殖，从而改善宿主健康的 有机物质。益生元目前有功能性低聚糖类、多糖类、天 然植物提取物、多元醇等类别 。目前研究主要集中 在低聚糖类物质，如琼胶寡糖和褐藻胶低聚糖都是新型益生元。

1 材料与方法

1.1 实验时间、地点

实验于2018年7—8月在中国科学院海洋研究所实验室进行。

1.2 实验材料、仪器

1.2.1 材料

蜈蚣藻由中国科学院海洋研究所提供，双 歧杆菌由青岛优比特生物技术有限公司提供，大肠杆 菌为中科院海洋研究所生物技术中心保存菌种，金黄 色葡萄球菌为中科院海洋研究所生物技术中心保存菌 种。

1.2.2 试剂

95%乙醇（国产分析纯级），MRS固体培养 基（青岛日水生物技术有限公司），MHB培养基（青岛 海博生物技术有限公司）。

1.2.3 主 要 仪 器

Hitech- Kflow Water Purification System（上海和泰仪器有限公司），SARTORIUS 精密 分析天平（德国 SARTORIUS 公司），RV10 旋蒸仪（德 国IKA公司），YXQ-LS-100A压力蒸汽灭菌锅（上海博 讯实业有限公司医疗设备厂），FD-1冷冻干燥机（北京德天佑科技发展有限公司），DK-S24精宏水浴锅（上海精宏实验设备有限公司），DHG-9070A烘箱（上海精宏 实验设备有限公司），超声清洗仪，96 孔板，接种环， iMark酶标仪（BIO-RAD公司），78-1型磁力加热搅拌 器（常州国画电器有限公司），722S分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），AIRTECH洁净工作台（苏州 安泰空气技术有限公司），电热恒温培养箱（上海精宏 实验设备有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 蜈蚣藻多糖的制备

用烧杯称量 40 g 干燥蜈蚣 藻，用剪刀剪碎，置于锥形瓶中，封口，加水至料液比1: 60。使用压力蒸汽灭菌锅100℃加热120 min，筛去杂 质后进行旋转蒸发浓缩，将其灌入透析袋中依次使用 静水、流水、蒸馏水进行透析除盐，第2次旋转蒸发浓 缩后加3倍体积的95%乙醇醇沉（过夜）。过滤并收集 沉淀，将其平铺于物料盘中冷冻干燥12 h得到蜈蚣藻 粗多糖。干燥至恒重后，计算提取率并将其在阴凉通风处保存。

1.3.2 蜈蚣藻多糖对双歧杆菌益生效应的实验

（1）配制MRS固体培养基200 mL，灭菌后取3 mL 于厌氧管中制成斜面。配制100 mL 1%的双歧杆菌菌 液（1 g固体菌粉溶于100 mL无菌水），取100 μL接种 于厌氧管中，充氮气营造厌氧环境，37℃下培养48 h后 转入4℃冰箱保存备用。
（2）配制液体 MRS 培养基，分装至锥形瓶中，灭 菌，迅速冷却至室温后用接种环接种培养48 h的双歧 杆菌，封口后再用 parafilm 封口膜封口，防止氧气进 入，37℃下静置培养48 h。
（3）准确称取蜈蚣藻多糖样品 0.100 g，在超声清 洗仪下溶于10 mL无菌水，配成1%的溶液后分别稀释 为 0.8%、0.6%、0.4%、0.2%，使接种后浓度分别变为 0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%。将培养48 h的双歧杆 菌菌液从锥形瓶底部吸取少许，用MRS液体培养基稀 释至0.5个麦氏比浊度。分别吸取稀释后的菌液和各 浓度糖样品溶液100 μL于96孔板的微孔中，每个样品 的每个浓度设置8个平行，对照组加入100 μL稀释菌 液和100 μL无菌水。
（4）接种完毕后用酶标仪在630 nm波长下测定吸 光度，放于37℃静置培养，之后保持每隔6 h检测吸光 度值，每次检测完都用parafilm封口膜将96孔板四周封住 。

2 结果与分析

蜈蚣藻多糖对双歧杆菌生长影响如图 1，可以看出自接种6 h后各样品开始明显增长，在12 h时低聚果 糖和阴性对照组样品基本不再增长达到平稳，低聚果糖高于对照组，且随低聚果糖浓度增大而增大。5 个蜈蚣藻多糖样品在21 h之前一直比较接近并保持增 长，但21 h之后浓度较高的0.5%、0.4%、0.3%保持平稳 增长，0.2%、0.1%在 24~42 h 中有明显下滑，之后 42~48 h迅速增长并接近0.5%、0.4%、0.3%。在66 h 5个蜈 蚣藻多糖样品最终结果较接近，仍保持增长趋势，且显 著高于低聚果糖组。

蜈蚣藻多糖与低聚果糖对金色葡萄球菌和大肠杆 菌作用结果较为接近，都没有抑制作用，都具有较弱的 促进生长作用。鉴于低聚果糖已经商业化并应用于工 业及食品行业，可以初步判断蜈蚣藻多糖较安全，但仍 需要进行进一步的体内实验，以了解它在体内复杂的 环境下被消化酶分解的情况，以及是否具有通过促进 双歧杆菌等有益菌的生长抑制大肠杆菌等病原菌等有害菌生长的作用。

3 结论

蜈蚣藻多糖对双歧杆菌的增殖具有显著的促进作用，但是从0.3%浓度到0.5%浓度的增长，没有提升对 双歧杆菌增殖的促进作用，可见在此范围内蜈蚣藻多 糖浓度与益生效应没有明显的相关关系，但蜈蚣藻多 糖的促进作用显著优于低聚果糖。因此，蜈蚣藻多糖 具有较好益生效应。蜈蚣藻多糖对双歧杆菌增殖的促 进作用与浓度在一定范围内具有一定正向关系，如果 经过进一步的实验验证，可以被开发为一种新的、更为 高效的益生元，调节人体的免疫力、增强体质，或者作 为双歧杆菌的促生长因子而应用于酸奶的发酵工业 中。