S胎儿水肿综合征胎儿家系分析-恒温水浴摇床使用

α－地 中 海 贫 血 主 要 由 位 于１６号 染 色 体１６ｐ１３．３ 位点的珠蛋白 基 因 缺 失、点 突 变，引起相应珠蛋白链 的合成受到抑制或功能丧失所致。α－珠蛋白基因突变 大 多 数 为 大 片 段 缺 失 引 起，同 时 包 含 少 量 的 点 突 变。

１ 资料与方法

１．１ 一般资料

先证者，孕２３周胎儿，其父母均为梧 州市藤县人。先证者父母于２０１２年在某县医院进行 婚前 检 查，血细胞检查均显示为小细胞低色素性贫 血，Ｈｂ分析 显 示 血 红 蛋 白 Ａ２（ＨｂＡ２）正 常 和 偏 低。 母亲地中海贫血基因检测未见异常；父亲检出东南亚 缺失型α－地中 海 贫 血 杂 合 突 变。临 床 医 生 怀 疑 胎 儿 母亲为缺铁性贫血患者，补铁后未见平均红细胞体积 （ＭＣＶ）、平均红细胞血红蛋白含量（ＭＣＨ）等指标升 高，该女性于２０１４年曾产下健康一子，此次怀孕为第 二次怀孕，在孕２３周 进 行 Ｂ 超检查时发现胎儿心胸 比值增大、胎盘 增 厚 等 症 状，遂转诊来本院接受进一 步医学检查。医 生 建 议 采 用 羊 水 穿 刺 进 行 产 前 诊 断 分析，并对胎儿父母及其兄长进行地中海贫血筛查及 基因检测家系分析。

１．２ 仪器与试剂

α－缺失型地中海贫血基因检测试 剂盒为深圳益生堂生物企业有限公司产品。微 量 样 品基 因 组 ＤＮＡ 提取试剂盒为北京天根有限公司产 品。β－地中海贫血及α－非缺失型地中海贫血基因检测 试剂盒为亚 能 生 物 技 术（深 圳）有 限 公 司 产 品。ＰＣＲ 扩增使用 Ｈｅｍａ９６００ＰＣＲ扩增仪，凝胶成像使用黑马 ＧＳＧ－２０００凝胶成像 系 统，分子杂交使用精宏恒温水 浴摇床。ＳｙｓｍｅｘＸＮ－１０００全自动血液分析仪为日本 Ｓｙｓｍｅｘ公司产品，Ｂｉｏ－ＲａｄＶＡＲＩＡＮＴＴＭ Ⅱ Ｈｂ分 析系统为美 国 Ｂｉｏ－Ｒａｄ公 司 产 品，Ｌａｂ－Ａｉｄ核 酸 提 取 仪为厦门致善生物科技股份有限公司产品。

１．３ 方法

１．３．１ 血 细 胞 检 查

采 用 ＳｙｓｍｅｘＸＮ－１０００全 自 动 血液分析仪 进 行 血 常 规 检 测，ＭＣＶ＜８２ｆＬ、ＭＣＨ＜２７ｐｇ作为地中海贫血初筛标准。

１．３．２ Ｈｂ组 分 分 析

采 用 Ｂｉｏ－ＲａｄＶＡＲＩＡＮＴＴＭ Ⅱ Ｈｂ分析系统进行 Ｈｂ组分分析，ＨｂＡ２＞３．５％或 （和）血红蛋白 Ｆ（ＨｂＦ）＞２．６％作为β－地中海贫血筛 查标准。

１．３．３ 地中海贫血基因检测

（１）外周血 ＤＮＡ 提取， 采用 Ｌａｂ－Ａｉｄ核酸提 取 仪 进 行 外 周 血 ＤＮＡ 的 提 取。
（２）羊水 ＤＮＡ 提 取，羊 水 穿 刺 取 两 份 羊 水 标 本，１份 羊水标本用于细胞培养，培养７ｄ后用其细胞做平行 管基因分析，两次结果一致方能发出报告。另１份羊 水标本以４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，去上清液保留沉 淀物（羊水细胞）转 移 至１．５ ｍＬ 离 心 管 中，采 用 微 量 样品基因组 ＤＮＡ 提取试剂盒（离心柱型）提取 ＤＮＡ， 离心管中加入细胞裂解液及蛋白酶 Ｋ 消化，转移裂解 液至吸 附 柱，洗 脱 ＤＮＡ。
（３）ＤＮＡ 扩 增：采 用 Ｇａｐ－ ＰＣＲ 法 检 测 α－缺 失 型 地 中 海 贫 血－－ＳＥＡ／、－－ＴＨＡＩ／、－ α３．７／、－α４．２／４种缺失型。α－缺失型扩增程序为９６ ℃，５ ｍｉｎ；９８℃，４５ｓ，６５℃，９０ｓ，７２℃，３ｍｉｎ，１０个循环； ９８ ℃，３０ｓ，６５ ℃，４５ｓ，７２ ℃，３ ｍｉｎ，２５ 个 循 环；７２ ℃，１０ｍｉｎ。采用 ＰＣＲ－反向点杂交法检测 ＣＤ４１－４２、 ＩＶＳ－Ⅱ－６５４、－２８、ＣＤ７１－７２、ＣＤ１７、βＥ、ＣＤ４３、－２９、 ＣＤ３１、－３２、ＩＶＳ－Ⅰ－Ⅰ、ＣＤ２７／２８、－３０、ＣＤ１４－１５、ＣＡＰ、 Ｉｎｔ、ＩＶＳ－Ⅰ－５１７种 β－地 中 海 贫 血 位 点 突 变 和 αＱＳα、 αＣＳα、αＷＳα３种α－非缺失型地中海贫 血 突 变。β－地 中 海贫血及α－非缺失型地中海贫血点突变扩增程序 为 ５０℃，１５ｍｉｎ，９５℃，１０ｍｉｎ；９４℃，６０ｓ，５５℃，３０ｓ， ７２ ℃，３０ｓ，３５ 个 循 环；７２ ℃，５ ｍｉｎ。
（４）电 泳 与 杂 交：α－缺失型地中海贫血检测取 ２μＬ 扩 增 产 物，用 １．０％琼脂糖凝胶（内加核酸染料）在５ｖ／ｃｍ 电压下电 泳６０ｍｉｎ，在黑马凝胶成像系统上观察结果。β－地中 海贫血及α－非缺失型地中海贫血点突变检测，使用恒 温水浴摇床于４２ ℃杂交１．５～４．０ｈ。洗膜，显色后观 察结果。

１．４ 统 计 学 处 理

采 用 Ｅｘｃｅｌ２００７软 件、ＡｕｔｏＣＡＤ 绘图工具分别进行数据、图像处理。

２ 结　　果

夫妻双方的血液学结果均为小细胞 低色素贫血。Ｈｂ分析结果正常或偏低。见表１。

先 证 者 α－地中海贫血基因检测 出－－ＳＥＡ／－－ＴＨＡＩ双重杂合突变，β－地中海贫血基因１７种 位点突变检 测 未 见 异 常。先 证 者 母 亲α－地 中 海 贫 血 基因检测出－－ＴＨＡＩ／αα杂合突变，β－地中海贫血基因１７ 种位点突变 检 测 未 见 异 常。先 证 者 父 亲 α－地 中 海 贫 血基因检 测 出－－ＳＥＡ／αα杂 合 突 变，β－地中海贫血基因 １７种位点突变检测未见异常。先证者兄长α－地中海 贫血基因检测未见异常，β－地中海贫血基因１７种位点 突变检测未见异常。

３ 讨　　论 　　

泰国缺失型α－地中海贫血属于罕见型缺失型地 中海贫血，为α－珠蛋白基因簇大片段缺失，且 断 裂 点 及缺失区域明确，缺失范围为ｃｈｒ１６：１９９８００－２３３３００， 包括ζ、α１、α２ 基 因 在 内 的 ３３５０１ 个 碱 基。采 用 Ｇａｐ－ＰＣＲ 分析技术可以检测东南亚型缺失（－－ＳＥＡ／）、 泰国型 缺 失（－－ＴＨＡＩ／）、右 侧 缺 失（－α３．７／）、左 侧 缺 失（－ α４．２／）４种α－地中海贫血基因缺失型。