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春雷霉素(Kasugamycin)又名春日霉素､加收米､加瑞农等,是由春日链霉菌(Streptomyceska-sugaensis)所产生的一种氨基糖苷类抗生素.春雷霉素作为农用杀菌剂,被广泛应用于农业生产,不仅具有较好的防治植物疾病的效果,并且对人畜无毒害作用,无污染和无残留符合现代环保要求,是目前最具推广前景的绿色农药之一,也是当前农作物病虫害防治中具有广阔发展前景的农药之一.春雷霉素的结构由春雷胺(Kasugamine)､D-肌醇(D-inositol)和二碳侧链(Two-carbonsidechain)共三部分组成,如图1所示。
传统育种中,春雷霉素产生菌通常采用紫外线照射法进行诱变育种.Genomeshuffling技术是利用基因洗牌技术在全基因组水平上的拓展,采用递归原生质体融合的方法来模拟基因组洗牌技术中的PCR热循环.可以对不同突变表型的若干个菌株的全基因组进行随机的重组,从而选育出具有良好生产性能､遗传特征具有较大改进的杂交菌株的方法.例如,Zhang等利用基因组洗牌育种的方法提高弗氏链霉菌的泰乐菌素的产量;龚国利等通过基因组洗牌技术选育埃博霉素B高产菌株,使得纤维堆囊菌的埃博霉素B产量提高了35.1倍.本文以从不同发酵罐批分离筛选到5株遗传多样性的春雷霉素生产菌株作为出发菌株,通过基因组洗牌技术选育出高产春雷霉素的重组菌株。
从不同发酵罐批分离筛选到5株春雷霉素产 生菌S17-128,S17-261,S18-050,S18-051,S18- 081,其春雷霉素的产量分 别 为 14007,14738, 14520,14551和14048 mg/L,这5个 菌株 作 为 Genomeshuffling 育 种 的 出 发 菌 株,工 业 生 产 菌 KB2010S17-182由 陕西 麦 可 罗 生 物 科 技 有 限 公 司提供.菌株培养在小金色链霉菌固体平板上,菌 体细胞悬浮在40%甘油溶液中低温冰箱保存.指示菌:灰梨孢菌 DLB2015由陕西麦可罗生物科技有限公司提供。
(1)斜面培养基及分离培养基:葡 萄 糖(AR) 1.0%､蛋白胨(BR)0.3%､黄豆饼粉(IR)1.0%､ NaCl(AR)0.5%､CaCO3(AR)0.3%､琼脂2%, 蒸馏水配制,消前pH7.2~7.4。
(2)摇瓶种子培养基:玉米油2%､豆饼粉5%､ 卵磷脂0.2%､磷酸氢二钾0.5%､硫酸镁0.05%､ 氯化钠0.2%,pH 自然。
(3)摇瓶发酵培养基:玉 米 油 2%､卵 磷 脂 0.5%､豆 饼 粉 5%､磷 酸 氢 二 钾 0.2%､硫 酸 镁 0.1%､氯化钠0.3%,pH 自然。
(4)种子罐培养基:玉米油2%､豆饼粉5%､卵 磷脂0.2%､磷酸氢二钾0.3%､硫酸镁0.05%､氯 化钠0.2%,pH 自然。
(5)发酵罐培养基:豆油2%､豆饼粉6%､卵磷 脂0.5%､硫酸铵0.01%､磷酸氢二钠0.1%､磷酸 二氢钾0.3%､硫 酸镁0.01%､氯 化钠0.2%,pH 自然。
(1)TPM 液:0.001mol/LK2HPO4-KH2PO4, 0.008mol/L硫酸镁,0.01mol/LTris-HCl,pH7.6, 灭菌备用。
(2)Tris缓 冲液:0.067 mol/L,pH8.0,灭 菌 备用。
(3)EDTA 溶液:称取5gEDTA 于90mL水 中溶解,调节pH 至8.0,然后定容至100mL,灭菌 备用。
(4)MMM缓冲液:0.02mol/L马来酸,0.3mol/L 甘露醇,0.02mol/L氯化镁,pH6.5,灭菌备用。
Lyticase(10U/μL)溶菌酶,购自上海翊圣生物科技有限公司。
(1)摇瓶培养条件:培养液30mL/300mL 广 口三角瓶,培养 温 度28 ℃;转 速220rpm;培 养周 期30~36h。
(2)种子罐培 养 条 件:培 养 温 度28 ℃;通 气量 1∶1VVM;搅拌转速300rpm;培养周期24~28h; 接种量1%。
(3)发酵罐培养条件:培养温度28℃;通气量1∶ 0.7VVM;搅拌转速150rpm;发酵周期192~210h; 接种量10%。
MQD-0.4型压力蒸汽灭菌器(邢台医疗器械 厂),OLYMPUSCX31RTSF 显 微镜(日本Olym- pus公司),YT-CZ-ZN 超净工作台(北京亚泰科隆 有限公司),MBR-304DR血液保存箱(深圳市凯铭 杰仪器设备有限公司),HY-5回旋多用振荡器(金 坛市华峰 仪 器 有 限 公 司),HW·SY21-KP4 电子恒温水浴锅(北京市长风仪表仪器厂),LC-10Avp 液相色谱仪(岛津仪器(苏州)有限公司),SHP-080生化培养箱(上海精宏实验设备有限公司, 无菌96孔板(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)。
无菌操作取 不 同 发 酵 罐 批 发 酵190h的 发酵 液,在无菌室超净工作台内将无污染的发酵液划线 在分离培养基上,28 ℃恒 温恒 湿 培 养9~11d后 取出平板,在无菌室超净工作台内挑取草帽型灰色 菌落,转接后进行划线分离,直至挑取到单个菌落, 其孢子生长丰满,呈灰白色至粉灰色,基内菌丝及 分泌的可溶性色素为淡黄色.然后挑取单菌落作为 种子菌进行液体培养2~3d,离心收集菌体。
收集 出 发 菌 株,调 整 其 浓 度 为 1×106 cell/ mL,MMM 缓冲液悬浮,加入10U/μL 的溶壁酶 液,28 ℃,30 min进 行酶 解,离 心 收 集 原 生 质 体, MMM 缓冲液重悬离心后继续用 MMM 缓冲液悬 浮备用.取酶解完全的原生质体悬液0.5mL,适量 MMM 缓冲液稀释后于斜面培养基,28 ℃培 养直 至观察到单菌落。
本研究采用灭活原生质体融合,提高了基因组 洗牌育种的效率. 紫外线灭活:在无菌室超净工作台内,把 悬 浮 的原生质体转到 Φ9cm 的无菌平皿内,于30W 的 紫外灯下,分别照射20s､40s､60s､80s和100s进行紫外灭活,经再生培养检查灭活效果. 加热灭活:把悬浮的原生质体转到无菌试管中 分别置于不同温度水浴(40､50和60 ℃),热灭火 处理1min､3min､5min和7min,然后利用再生 培养检查其灭活的效果. 取1mL 浓度为1×108cell/mL 不 同灭 活 的 出发 菌 株 悬 液 混 合,离 心 收 集,弃 上 清 液 后 用 MMM 缓冲液悬浮.随后加入2mL40%的 PEG- MMM,28 ℃ 15min.离心 MMM 洗涤,MMM 重 悬,利用双层培养法再生,28 ℃培养9~11d.融合 率通过融合子和灭活亲本的再生情况进行计算. 首先选 取 的 PEG 浓 度为 10%､20%､30% 和 40%,反应时 间 为10 min,得 到最 佳 浓 度 后,设 置 5min､10min､15和20min不同对反应时间进行 实验. 融合率a=[(b-c)/d]×100%,式 中a 为原 生质体融合率;b为融合再生的菌落数目;c为灭活 亲本再生的菌落数目;d为亲本再生的菌落数目。
将灭活后的原生质体在合适条件下进行随机 融合,通过双层平板培养法再生后,平板上的再生 菌落为 F1代的融合菌群;然后将其作为出发菌 株,灭活后再融合,再生,反复重复5轮融合再生后 得到 F2代 融 合 菌 群,然 后 反 复5轮 融 合 再 生.获 得的最终菌群对其筛选和检测,从而获得到高产春 雷霉素菌株 .其中对照组为加入的溶菌酶用无 菌水代替,其他实验步骤一致。
本实验通过高通量筛选法进行筛选,首 先 在 96孔板中的孔 中 加 入200μL 灭菌的 固 体 发 酵 培 养基,平行接种诱变菌株于两块96孔板(a板和 b 板).然后再a板的孔加入适量的灰梨孢菌,28 ℃ 培养9~11d,然后用微板光谱仪进行检测,选取透 光度较大的菌株作为 目 标 菌 株.b板 于20 ℃下 培 养4d后,保藏于4 ℃冰箱待用.等a板培养结束 后,从b板上取出相应的菌株进行检测。
将初筛获得的高产重组子通过液体摇瓶扩大 培养40h,然后按照1∶50的接种量接种于发酵培 养基.发酵体系:300 mL 三角瓶装 发 酵 培 养 基50 mL,28 ℃,220r/min培养144h.144h发酵液用 草酸调 pH3.0,5000r/min离 心10 min,收 集上 清液待用.然后上清液采用 HPLC(岛津高效液相 色谱系统)进行定性和定量测定. 色谱 柱:150×3.9 mm(id)不 锈 钢 色 谱 柱ODS,粒径5μm; 流动相:4.0g十二烷基硫酸钠溶于纯水中, 加200mL乙腈,定容至1L,用磷酸调pH2.55,过 滤超声后备用. 流速:1.0mL/min; 检测波长:紫外检测仪,波长为210nm; 柱温:25~35 ℃; 进样量:5μL. 本实验的春雷霉素标准品购买于sigma公司。
获得的高产春雷霉素菌株进行传代培养5次 后,进一步利用发酵筛选,筛选得到春雷霉素产量 高并且遗传稳定性好的重组菌株,然后保藏菌种。
(1)标准溶液配制 称取标样0.05g(精确至0.0002g)置 于50 mL容量瓶中,用流动相溶解,稀释至刻度,摇匀。
(2)试样溶液的配制称取 约 含 春 雷 霉 素 0.05g 的 试 样 (精 确 至 0.0002g)置于50mL 容量瓶中,用流动相溶解, 稀释至刻度,摇匀,并用0.45μm 滤膜过滤,备用。
(3)测定 在上述条件下,待仪器稳定后,连续注 入 数 针 标准溶液,计算各针响应值的重复性,待相邻两针 的响应值变化 小 于1.5%时,按 照标 样 溶 液､试 样 溶液､试样溶液､标样溶液的顺序进行测定。
(4)计算 将测得的两针试样溶液以及试样前后两针标 样溶液中春雷霉素的峰面积分别进行平均,试样中 春雷霉素的质量分数 (%),按式(1)计算: ω1 =A2 ×m1 ×ω A1 ×m2 ×100% (1) 式(1)中:A1 -标样溶 液 中,春 雷 霉 素 峰 面 积 平均 值;A2 - 试样溶 液 中,春雷霉素峰面积平均 值;m1-春雷霉 素 标 样 的 质 量,g;m2 - 试样的 质 量,g;ω1-标样中春雷霉素的质量分数,%。
将不同批次的发酵罐中筛选到的具有遗传多 样性的菌株作为出发菌株,利用小金色链霉菌(S. microaureus)分离平 板 筛 选 到 了 到5株 遗 传 差 异 大的菌株,分别为 S17-128,S17-261,S18-050,S 18-051,S18-081,这5株菌株作为 Genomeshuff- ling的出发菌株.产量最高的菌株S17-261的春雷 霉素产量为14738mg/L,见图2所示。
基因组shuffling过程中的关键步骤在于原生 质体制备与再生,本实验中首先确定了制备和再生的培养基的种类､方法和渗透压稳定剂.另外酶解 的温度､时间和酶解前预处理的因素见表1所示. 结果表明,在制备原生质体时,EDTA 预处理细胞 可以提高细胞壁酶解的效率.通过实验结果,本文 最终选择的渗透压稳定剂为0.3mol/L的甘露醇, EDTA 预处理10min,酶解时间30min,原生质体 再生采用自然扩展法。
