棉花GhJAZ10基因的克隆及其对干旱胁迫的响应

茉莉酸(jasmonicacid,JA)是一类广泛存在于植物中的内源激素,不仅参与植物生长发育过程的调控,还作为信号分子在植物响应生物及非生物胁迫反应中发挥重要作用(Browse,2005;Michaeletal.,2015;Qu,Zhao,2011)｡研究表明,COI1(coronatineinsensitive1)-JAZ(jasmonateZIM-domain)-MYC2(myelocytomatosisproteins2)是JA信号传导的核心调控元件(Chinietal.,2010)｡其中转录抑制因子JAZ蛋白,在JA信号传导途径中将茉莉酸受体复合体SCF(Skip/Cullin/F-box)COI1与下游转录因子联系起来｡虽然已报道拟南芥(Arabidopsisthali⁃ana)､普通小麦(Triticumaestivum),但是仍未完全明晰JAZ蛋白调控植物应答逆境胁迫的生物学功能。

供试材料为陆地棉(Gossypiumhirsutum)'中棉所24'(CRI24)､棉花标准系TM-1､二倍体栽培棉亚洲棉(Gossypiumarboreum)'石系亚1号'和二倍体野生棉雷蒙德式棉(Gossypiumraimondii)｡将4种材料种子在自来水中浸泡12h,整齐摆放到浸湿的滤纸上;将滤纸卷成柱状,下部空出8~10cm浸入水中,以保持滤纸湿润,加水量以距离最下部种子1~2cm为宜｡放入30℃､70%湿度和16h/8h(光照/黑暗)的光照培养箱（上海精宏实验设备有限公司提供）中萌发3~5d,每隔12h加一次水｡待子叶破壳后移种到Hoagland培养液中,继续培养,每隔3d更换一次培养液｡待植株长到三叶一心,挑选长势一致的幼苗移入12%(W/V)PEG6000培养溶液;分别在处理后的0､0.5､1､3､6和12h取根､茎和叶,液氮速冻,于-80℃保存,用于胁迫条件下表达模式分析｡另将CRI24种子播种于试验田,常规种植,取开花期植株的根､茎､叶､花､萼片､胚珠､雄蕊､雌蕊和不同时期的纤维以及收获后的种子,液氮速冻,于-80℃保存,用于组织表达分析｡基因转化受体和野生型对照均为拟南芥(Ara⁃bidopsisthaliana)Colombia0(Col-0)型｡将转基因株系和野生型的拟南芥种子用50%次氯酸钠消毒5min,随后用灭菌H2O清洗5~6次;在4℃条件下春化2d,然后种在MS(MurashigeandSkoogStock)培养基｡生长8~10d后,株系移栽到蛭石∶营养土为1.2∶1的土壤中生长｡于培养皿中进行渗透胁迫处理:将消毒､清洗､春化后的种子均匀点播在MS和MS+Man(Mannitol甘露醇)的培养基上生长｡拟南芥和用于亚细胞定位的烟草(Nicotianatabacum)均生长于22℃､16h/8h(光照/黑暗)的温室中。

陆地棉CRI24三叶一心期根､茎和叶的混合组织样,液氮研磨至粉末状,采用RNAprepPure试剂盒(TIANGEN,北京)提取总RNA｡利用反转录试剂盒TrabsScriptAll-in-OneFirst-StrandcDNASynthesisSuperMixforqPCR(One-StepgDNARemoval)(全式金,北京)将总RNA反转录合成cDNA模板｡根据陆地棉基因组序列数据库(http://cgp.genomics.org.cn/)GhJAZ10基因序列,设计引物扩增GhJAZ10基因｡引物序列如下:GhJAZ10-F:5'-GCGGCCGCATGTCGTCTTGCTCGGAATCTAC-3'(划部分为NotⅠ酶切位点);GhJAZ10-R:5'-CCTGCAGGTGGTGATTGAGCAGCCAAACCG-3'(划线部为SbfⅠ酶切位点)｡PCR反应体系为:TaKaRaLATaq(5U/μL)0.5μL,10×LATaqBufferⅡ(Mg2+Plus)5μL,dNTPMixture(2.5mmol/L),1000ng/μLcDNA模板2μL,10μmol/L正反向引物各1μL,以ddH2O补足至50μL｡PCR反应程序为:94℃预变性1min;98℃变性10s,60℃退火30s,68℃延伸1min,32个循环;68℃延伸10min｡利用NotⅠ和SbfⅠ对克隆序列和表达载体GW303(重庆大学任茂志老师馈赠)进行双酶切,利用DNA连接酶SolutionⅠ(TaKaRa,大连)连接获得重组质粒,并将其转化农杆菌(Agrobacterium)GV3101。

以GhJAZ10推导的氨基酸序列为目标序列,在NCBIBLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)网站上进行BlastP分析,获得各物种同源基因并下载相应序列｡利用DNAManv6.0软件进行氨基酸序列比对,用MEME(http://meme-suite.org/)对GhJAZ10进行motif分析｡采用在线软件GeneStructureDisplayServer(GSDS:http://gsds.cbi.pku.edu.cn)对GhJAZ10的外显子和内含子进行分析。

棉花根､茎､叶､花､种子､萼片､雄蕊､雌蕊､胚珠､纤维组织和12%PEG6000胁迫处理0､0.5､1､3､6和12h的根､茎和叶组织,以液氮研磨至粉末状;参照1.2.1方法提取总RNA并反转录合成cDNA,对GhJAZ10表达量进行分析

对克隆获得的GhJAZ10基因进行结构分析发现,该基因(GenBankNo.XM_016834302.1)全长723bp,编码240个氨基酸;包含4个外显子和3个内含子｡该基因编码产物含有1个高度保守的TIFYXG结构域和1个C端Jas保守结构域｡以GhJAZ10氨基酸序列为探针,在NCBI网站GenBank数据库中搜索得到同源的亚洲棉､雷蒙德式棉及其他物种同源氨基酸序列｡利用DNAMan软件进行序列比对,结果显示,GhJAZ10氨基酸序列与棉属间2个基因GaTIFY10A-like(Gossypiumar⁃boretum,XM_017791531.1)､GrTIFY10A-like(Gossyp⁃iumraimondii,XM_012590406.1)的相似性均在95%以上;与其他物种间的相似性在60%左右,其中与哥伦比亚锦葵(Herraniaumbratica)HuTIFY10A(XP_021277209.1)的相似性最大(65%)｡上述结果表明,棉属之间的序列相似性很高,在进化过程中该基因未发生明显的碱基改变;而与其他物种同源基因的序列差异较大｡尽管如此,不同物种的序列都具有保守的TIFY和Jas结构域,而该两种结构域是JAZ蛋白发挥功能的重要结构｡在MEME网站对TIFY和Jas进行motif序列分析,结果显示,TIFYmotif的氨基酸序列为TIFYXG,Jasmotif的氨基酸序列为SLX2FX2KRX2RX5PY。