精宏磁力搅拌器对皮肤创伤愈合作用研究的作用

皮肤是脊椎动物最大的器官，具有自我修护的 能力，在抵御体外侵害过程中起着关键 的 作 用。创伤愈合是一个动态协调组织修复过程， 包括止血、炎症、细胞增殖和重塑等一系列复杂的 过程。在每个调控环节，干扰影响其创伤修复的主 要因素包括机体免疫及巨噬细胞的活力、氧化应激 产生过量过氧化物、血小板的激活、各种因子的释 放等。目前，常用的创伤修复药物主要有基因 工程细胞因子、抗菌药物、酶清创制剂、中药制 剂、抗氧化剂和皮质类固醇等。然而，针对皮 肤外伤的天然无瘢痕制剂及创伤患者专用型临床营 养品却非常缺乏，急需开发有助于创伤愈合的天然 活性物质。随着国内外对海洋来源活性肽功能的深入研究，已发现部分活性肽在皮肤组织创伤愈合方 面具有较高的潜在应用价值，如海洋胶原蛋白 肽、鱼皮胶原蛋白肽等，而贝类来源的活性 肽物质目前尚未见在创伤愈合领域的报道。

马氏珠母贝 Pinctada martensii 又称合浦珠母 贝，是中国南方沿海地区培育珍珠的主要贝种。 随着人工海水珍珠养殖面积的增多，马氏珠母贝产 量日益递增，是南海主要的渔业资源之一。养殖珍 珠贝主要用于珍珠的采集，珍珠贝肉作为珍珠副产 品，其利用程度低，主要用作鲜食或简单加工成动 物饲料，产值低且易对环境造成污染。因此，髙值 化利用是提高马氏珍珠贝产业经济附加值的重要手 段。珍珠贝外套膜作为实施人工 “插核手术”的组织小片，具有较强的细胞增殖和组织修复能力，并 最终形成珍珠袋，在珍珠形成和免疫抗炎中起着重 要的作用。研究表明，珍珠贝外套膜主要营养 成分是蛋白质，主要为胶原蛋白。胶原蛋白作 为细胞外基质重要组成成分之一，对多种细胞的生 理功能具有促进作用，并诱导多种生长因子的产 生，有利于伤口愈合。因此，本研究中采用酶 法制备马氏珠母贝外套膜酶解产物 ( enzymatic hydrolysis from mantle of pearl oyster，EHM) ，并探讨 了其促进小鼠皮肤软组织创伤愈合作用，以期为进 一步利用马氏珠母贝外套膜开发皮肤组织创伤愈合 功能的产品和深入研究其机制提供数据参考。

试验用马氏珍珠贝肉于 2018 年 6 月采自广东 省湛江市雷州市流沙养殖场，取其外套膜。 试验试剂: 初元Ⅰ型产品 ( 主要成分为小麦 低聚肽、海洋鱼皮胶原低聚肽) ，购自江中集团股 份有限公司; SPF 级 KM 小鼠体质量为 ( 20±2) g， 雄性，购于山东省济南朋悦实验动物繁育有限公 司; 中性蛋白酶 ( 30 000 U/g) 购自广西南宁庞博 生物工程有限公司; 白介素－6 ( interleukin 6，IL－ 6) 、白介素－10 ( interleukin 10，IL－10) 、转化生 长因子 β ( transforming growth factor－β，TGF－β) 、 碱性成纤维细胞生长因子 ( fibroblast growth factor 2，FGF － 2 ) 、 表皮细胞生长因子 ( epidermal Growth Factor，EGF) 、细胞生长周期素 1 ( cyclin D1，CCND1) 和羟脯氨酸测定试剂盒购自南京建 成生物工程研究所。 试验仪器: Lynx 6000 型高速冷冻离心机、多 功能酶标仪购自 Thermo 公司; BSA224S－CW 型万 分之一电子天平购自赛多利斯科学仪器 ( 北京) 有限公司; FE28 型 pH 计购自梅特勒－托利多仪器 ( 上海) 有限公司; DF－101T 集热氏恒温加热磁力 搅拌器购自上海精宏实验设备有限公司; FDU － 1110 型冷冻干燥机购自上海爱朗仪器有限公司; SW－CJ－2FD 型双人超级操作台购自苏州净化设备 有限公司。

参照前期团队的酶解工艺 制备 EHM。采 用 凯 氏 定 氮 法、甲 醛 滴 定 法、双缩脲法分别测定蛋白质含量、水解度和肽含量。

将小鼠按体质 量随机分为 5 组，每组 20 只，分别为阴性对照组 ( 生理盐水，剂量为 0. 1 mL /10 g 体质量) 、初元Ⅰ 型产品阳性对照组及 EHM 低 ( 0. 25 g /kg 体 质 量) 、中 ( 0. 5 g /kg 体质量) 、高 ( 1 g /kg 体质量) 剂量给药组。将小鼠用 10%水合氯醛腹腔麻醉后， 背部剃毛、消毒，在小鼠背部剪去直径约 0. 8 cm 的全层皮肤，造成全皮层创伤动物模型。小鼠均单 独分笼饲养，每天灌胃给药，每两天对创伤口面观 察、拍照，测量伤口大小，并记录结果。每组试验 设 3 个平行。

每隔两天用游标卡 尺测量创面直径 ( cm) 大小一次，计算创伤愈合率:

创伤愈合率= ( 第 0 天创面直径－第 n 天创 面直径) /第 0 天创面直径×100%。
 

第 14 天时测量瘢痕长度 ( cm) ，计算瘢痕缩小率:

小鼠创面组织 匀浆液制备参照赵秉江的方法，分装后保存于 超低温 冰 箱 ( － 80 ℃ ) 中 待 测。IL － 6、IL － 10、 TGF－β、FGF－2、EGF、CCND1 和羟脯氨酸含量的 检测均按照相应试剂盒说明书进行。

试验数据采用平均值±标准差 ( mean ±S. D. ) 表示，采用 SPSS 20 软件进行单因素方差分析，采 用 LSD 法进行组间多重比较，显著性水平设为 0. 05，极显著性水平设为 0. 01。

制备 EHM 时，选用中性蛋白酶酶解，加酶量 为 1000 U/g ( 原料) 蛋白，温度为 50 ℃，酶解时 间为 5 h，该条件下水解度为 23. 4%，制得的 EHM 冻干粉蛋白质含量为 55. 66 g /100 g，其中，肽含 量占蛋白质含量的 21. 56%。

造模后 第 2 天，各试验组动物创面皆已结痂，伤口周围出 现红肿，无液体渗出，伤口收缩均不明显; 第 4、6、8 天时，各组创面结痂不断变硬，创伤周围表 面不平整，创缘皮肤收缩明显，其中，各给药组结 痂厚度优于对照组，创面完全封闭，呈现黑红色; 第 10 天时，两对照组伤口结痂部分脱落，但瘢痕 面积变化小，各给药组小鼠伤口明显缩小，并开始 部分脱痂、缩痂明显; 第 12 天时，各组皆已掉痂，愈合处开始长出毛发，各给药组进一步缩痂，中、 高剂量组二次结痂; 第 14 天时，阴性对照组多数 伤口小于 2 mm，阳性对照组和各剂量组伤口直径 均小于 1 mm，低剂量组呈现肉红色新生皮肤，新 生肉色组织完整。总体来看，低、高剂量组较对照 组愈合情况良好，无增生性瘢痕及瘢痕疙瘩生成。

创伤愈合是一个动态协调组织修复过程，包括 3 个/4 个重叠阶段: 止血/炎症、细胞增殖和重塑。 本研究中初步探讨了珍珠贝外套膜酶解产物对小鼠 皮肤创伤愈合的影响，并以愈合阶段特征为切入 点，测定各阶段试验动物皮肤组织相关生化指标， 进一步探讨了其促进伤口愈合的可能作用机制，为 开发术后临床营养支持和防治创伤愈合不良的产品 提供重要科学依据。Pastar 等研究表明，IL － 6 由 M1 型巨噬细 胞分泌，属于促炎症因子; IL－10 由 M2 型巨噬细 胞分泌，属于抑制炎症因子。Du 等研究表明， 第 3、5 天是炎症反应阶段，IL－6 含量在损伤后 1 d 显著增加，在第 3 天时达到峰值，第 7 天时 IL－6 含量减低。本研究结果表明，不同剂量的 EHM 对 创伤皮肤组织中 IL－6 含量的影响不显著; 第 3 天 时，各给药组创伤模型动物皮肤组织中 IL－10 含量 极显著高于阴性对照组，同时，随时间延长含量降 低，这与张慧等报道的 IL－10 含量在第 3 天时 达到高峰期，之后开始下降的研究结果一致。Du 等研究表明，通过减少促炎 M1 巨噬细胞极化 和促进抗炎 M2 极化可减轻炎症。本研究中阳性对 照组 ( 初元Ⅰ型产品) 配方中的海洋鱼皮胶原低 聚肽、酪蛋白磷酸肽具有抑制炎症功效，与试验结果一致。同时，EHM 有较高含量的蛋白及 肽，这有利于 EHM 促进 IL－10 分泌，从而起到抑 制炎症反应的作用。