多巴胺的检测研究分析

多巴胺( DA) 是人体内一种重要的儿茶酚胺类神经传递物质，是体内去甲肾上腺素或肾上腺素生物 合成的前体，对神经中枢、心血管、肾脏及激素分泌系统以及中枢神经系统的精神活动有重要的调节作用。若人体内的多巴胺分泌不足，可能导致神经肌肉失调，甚至引发帕金森氏症、老年痴呆症、癫痫症、心脏病等疾病，因此，体内多巴胺含量可作为临床上一些疾病的重要诊断依据，对 多巴胺进行简单、快速、准确的检测具有十分重要的理论意义和临床应用价值。

微波炉( 格兰仕集团) ; Agilent Cary100 紫外可见分光光度计( 美国安捷伦科技公司) ; F － 7000 荧 光光谱仪( 日本日立公司) ; pHS － 3C 型酸度计( 上海雷磁仪器公司) ; HH － S2 数显恒温水浴锅( 金坛 市医疗仪器厂) ; TGL － 20M 型台式高速冷冻离心机( 上海卢湘仪离心机有限公司) ; Nicolet 5700 型傅 立叶红外光谱仪( 美国 Thermo 公司) ; JEM － 2100 透射电子显微镜( 日本电子株式会社) ; ESCALab250 X-射线光电子能谱仪( 美国 Thermo 公司) ; FLS － 920 光谱仪( 英国爱丁堡仪器公司) ; DHG － 9146A 电 热恒温鼓风干燥箱( 上海精宏实验设备有限公司) 。 盐酸多巴胺( 纯度≥ 99. 0% ，上海毕得医药科技有限公司) ，柠檬酸、尿素( 纯度≥ 99. 0% ，九鼎 化学( 上海) 科技有限公司) 。其他所用试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

准确称取 0. 5 g 柠檬酸和 0. 3 g 尿素于 100 mL 锥形瓶中，加水 10 mL 溶解，置于微波炉中央位置 于高火档( 700 W) 微波 3 min，得到棕黑色物质，将棕黑色物质冷却至室温，加水溶解，然后离心 10 min( 10 000 r/min) ，取上清液用 0. 22 μm 滤膜过滤，再用截留量 500 kD 的透析袋透析 24 h( 每 3 h 换 水一次) ，除去未反应的柠檬酸和尿素，制得纯净的 N-CDs 溶液。加适量水稀释配制成浓度为 0. 3 mol / L 的 N-CDs 母液( 以碳计) ，储藏于 4 ℃冰箱中备用。

将硫酸奎宁溶于 0. 1 mol /L H2 SO4 中，制得硫酸奎宁溶液( Φs = 54. 0% ，360 nm) ，以其作标准物， 根据 Φx = Φs × Ix /Is × As /Ax × η2 x /η2 s 计算荧光量子产率。式中，Φ 为荧光量子产率，I 为荧光发射峰 积分面积，A 为激发波长处溶液的吸光度( 为了使再吸收效应最小化，所测溶液的吸光度值均应小于 0. 05) ，η 为溶剂的折射率; s 代表标准物，x 代表待测物。

在系列 5 mL 离心管中依次加入 0. 4 mL N-CDs、0. 4 mL B － Ｒ 缓冲溶液和一定体积的 DA 标准溶液 ( 0. 001 mol /L) 或其他干扰物质，用去离子水定容至 4 mL，充分混匀后，放入 45 ℃ 的恒温水浴锅中孵 育 4 h。随后，将离心管从水浴锅中取出，冷却至室温，于荧光光谱仪( λex = 360 nm，λem = 440 nm) 上 测定体系荧光强度( IF ) ，同时做 DA 试剂空白( IF0 ) 。

N-CDs 在溶液中分散性良好，基本呈规则的球形。为 N-CDs TEM 图上统计的大约 100 个碳点的粒径分布图，由 该 图 可 知，合 成 的 N-CDs 粒 径 范 围 为 0. 5 ～ 5 nm，主要分布在 2. 0 ～ 3. 5 nm 范围内，平均粒径为 2. 6 nm。图 1C 为 N-CDs 的原子力显微镜 ( AFM) 图，由图中可以看出，制备的 N-CDs 为规则的球形，AB 段的平均高度在 2. 4 nm 左右，与 TEM 的表征结果基本一致。两种表征均在纯水中进行样品制备，未经过进一步的超声处理，说明 N-CDs 在 水中具有很好的分散性。N-CDs 荧光发射峰的位置和强度依赖于激发波长。改变激发波长，N-CDs 的荧光发射峰和强度均随之改变。 随着激发波长由 320 nm 增加到 410 nm，荧光发射峰逐渐红移，发射波长由 441 nm 红移至 519 nm，同 时荧光强度先增大后减小。N-CDs 的这一荧光特性，可能与其表面缺陷及纳米粒子粒径对光的选择 性有关。根据 N-CDs 的荧光强度变化，后续试验选择最佳激发波长为 360 nm。以硫酸奎宁( 54% ， 0. 1 mol /L H2 SO4 ) 为参考物质，测得该 N-CDs 的荧光量子产率约为 5. 79% 。不同温度对 DA 猝灭 N-CDs 荧光的影响。结果显示，常温下 DA 对 N-CDs 的荧光几乎没有猝灭作用，随着温度的升高，荧光猝灭逐渐增强，当温度达 45 ℃时，荧光猝灭程度基 本达到最高，继续升温，猝灭效率改变很小。因此，实验选择在 45 ℃ 下孵育一定时间后进行荧光 测定。不同 pH 值条件下，孵育不同时间后 N-CDs － DA 体系的荧光变化情况。 结果表明，在 pH 7. 0 条件下，随着时间的增加，N-CDs － DA 体系的荧光强度变化不甚明显。pH 8. 0 和 pH 9. 0 时，随着时间的增加，N-CDs － DA 体系的荧光强度快速降低，孵育时间超过 4 h 后，荧光强 度下降趋缓，且两种 pH 值条件下的荧光强度变化趋势基本吻合。当 pH 10. 0 或 pH 11. 0 时，随着时间 的增加，N-CDs － DA 体系的荧光强度先迅速降低( 且 pH 值越大，下降越迅速) ，后又随着时间的增加 缓慢升高( 且 pH 值越大荧光强度增大趋势越明显) ，其原因可能是在强碱性环境中，多巴胺容易发生 聚合反应形成聚多巴胺。因此，实验选择在 pH 8. 0，孵育温度为 45 ℃ 的条件下，孵育 4 h 后测 定 N-CDs － DA 体系的荧光强度。

以柠檬酸为碳源，尿素为氮源，采用微波一步法合成了水溶性好，富含—OH、—COOH 和—NH2 等官能团的氮掺杂碳点，所制备的 N-CDs 对溶液中的 DA 具有良好的选择性、灵敏性和抗干扰能力， 基于此建立了一种新的、快速检测 DA 的方法。该方法的检出限达 0. 08 μmol·L － 1 。应用于实际样品 尿液中 DA 含量的检测，其加标回收率为 99. 5% ～ 106% ，ＲSD 为 1. 8% ～ 2. 3% 。该方法灵敏，简单， 易操作，在实际生物样品中 DA 含量的检测方面具有一定的应用前景。



 

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