恒温水浴锅在复合软骨修复支架的搭建中的使用

关节软骨中软骨细胞少，不能充分填充缺损 区，并且无血管结构，无神经组织，无论是急性、慢 性还是退化性疾病引起的软骨缺损，损伤后自我修 复能力差。传统的软骨修复方法，有微骨折手术、 骨软骨移植术、骨膜移植术等，存在供源不足、疾 病传播、免疫排斥等问题。组织工程的发展可解决 以上问题。本研究对α-1，3-半乳糖苷转移酶基因敲 除猪肋软骨脱细胞处理，获得低免疫原性细胞外基 质，与聚合物甲基丙烯酰化明胶（GelMA）溶液按不 同比例均匀混合，紫外交联制备复合材料支架，用 于软骨个性化修复。

α-1，3-半乳糖苷转移酶 基因敲除猪（南京华贞生物医药科技有限公司）； GelMA（温州优墨生物科技有限公司）；骨髓间充 质干细胞（美国ATCC）；Tris-HCl、十二烷基硫酸钠 （SDS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、4%组织细胞固定液、 中性树脂、Masson三色染色液（北京索莱宝生物科 技有限公司）；Aprotinin、Leupeptin（德国Roche 公司）；PMSF（美国Sigma公司）；胎牛血清、低糖 DMEM、0.25%胰酶（美国Gibco公司）；DNeasy Blood & Tissue Kit（德国QIAGEN公司）；胰蛋白酶（美国 Biosharp公司）；苏木素伊红染色液、青霉素链霉 素、DAPI（上海碧云天生物技术有限公司）；CCK-8 试剂盒（日本同仁公司）；Live/Dead试剂盒（美国 Thermo公司）；罗丹明标记的鬼笔环肽（上海翊圣 生物科技公司）。

冰冻切片机、NanoDrop（美国 Thermo公司）；扫描电镜（scanning electron microscope，SEM，日本Hitachi公司）；冷冻研磨仪（德 国Retsch公司）；正置荧光显微镜（日本Nikon公 司）；DHR流变仪（美国TA公司）；低温离心机（德国 Eppendorf公司）；电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；全波长微孔读板机（美国BioTek 精宏公司）；真空冷冻干燥机（北京博医康实验仪 器有限公司）；精密分析型电子天平（德国赛多利斯科学仪器有限公司）。

取新鲜基因敲除猪软骨 去除软组织及骨膜，切成约1.5 cm×0.5 cm×0.2 cm 的块状软骨，联合应用胰蛋白酶、去污剂、核酸酶、蛋白酶抑制剂对块状软骨进行脱细胞处理。具体脱 细胞流程如下（每进行下一步前均用超纯水清洗软 骨）：

①将块状软骨放入Tris-HCl溶液（10 mmol/L， pH 8.0）中孵化 24 h，控制温度于 45 ℃；

②在 0.25%的胰蛋白酶溶液中消化24 h，保持温度37 ℃， 作用24 h；

③放入含 0.1% SDS的Tris-HCl溶液 （10 mmol/L，pH 8.0）中24 h，恒温45 ℃；

④用 含0.1% EDTA的 PBS缓冲液，配制蛋白酶抑制剂 （PMSF 1 mmol/L、leupeptin 1 μg/mL、aprotinin 10 kIU/mL），放入该溶液中清洗2次，每次30 min， 恒温37 ℃；

⑤再次放入含0.1% SDS的Tris-HCl溶 液（10 mmol/L，pH 8.0）中，恒温45 ℃，孵化24 h；

⑥在50 mmol/L，pH 7.5的Tris-HCl溶液中，配制 氯化镁10 mmol/L、牛血清白蛋白50 μg/mL、DNA酶 50 U/mL和RNA酶1 U/mL，置于该溶液中作用3 h， 恒温37 ℃；

⑦在含有0.1% EDTA、蛋白酶抑制剂的 PBS缓冲液中，清洗2次，每次30 min，恒温37 ℃；

⑧PBS缓冲液反复多次清洗，-80 ℃保存备用。

将脱细胞软骨骨块 放在冷冻干燥机中冻干3 h，随后用冷冻研磨仪研 磨成骨粉。设置研磨频率为20 r/s，时间为15 min， 循环2次。过筛选取粒径＜100 μm的骨粉，-80 ℃ 保存备用。

①DAPI染色检测脱细胞 效果：将天然软骨、脱细胞块状软骨用冰冻切片机 切成厚度为5 μm的切片，做好标记，在切片上滴加 DAPI工作液，避光，室温孵育15 min，PBS漂洗3次， 每次5 min，封片后荧光显微镜下观察。

②软骨DNA 含量检测：称取天然骨粉、脱细胞骨粉各20 mg，装 入1.5 mL EP管中做好标记，取出DNeasy Blood & Tissue Kit，分别在EP管中加入 180 μL Buffer ATL，20 μL蛋白激酶K，混匀，在56 ℃下孵育2 h 直到组织裂解，在孵育过程中要间断振荡；加入 200 μL Buffer AL，混匀；加入200 μL无水乙醇， 混匀；将上述混合物移至 2 mL EP管中的DNeasy Mini滤柱中，6 000×g离心1 min后，弃去滤液、EP管； 将滤柱放入新的2 mL收集管中，加入500 μL Buffer AW1，6 000×g离心1 min后，再弃去滤液、收 集管；将滤柱放入新的2 mL收集管中，加入500 μL Buffer AW2，2 000×g离心3 min后，弃去滤液、收 集管；将滤柱移至新的1.5 mL EP管中，200 μL Buffer AE加到滤柱膜中央洗提DNA，室温下孵育 1 min，6 000×g离心1 min，重复1次；用Nanodrop检测DNA纯度、浓度，每个样品重复3遍，取平均值。

③PCR检测β-actin基因的表达：β-actin引物序列： 上游5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’，下游5’-CTCCTTA ATGTCACGCACGAT-3’，反应条件为94 ℃ 3 min，30 个循环94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃延伸 30 s， 最后72 ℃ 5 min，4 ℃保存。反应结束后用2%琼 脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统观察，拍照，分析。

HE 染色检测细胞外基质结构，步骤如下：将天然软骨、 脱细胞块状软骨用冰冻切片机切成厚度为5 μm的切 片，苏木素染色液染色10 min，自来水冲净多余的 染液，蒸馏水洗涤5 s后，伊红染色液染色3 min， 洗净多余染液，甘油封片，于显微镜下观察拍照。 Masson三色染色检测细胞外基质中胶原纤维成分， 步骤如下：取天然软骨与脱细胞软骨切片，用配制 好的Weigert铁苏木素染色液染色7 min；酸性乙醇 分化液分化10 s，水洗；蓝化液返蓝5 min；蒸馏 水洗1 min；丽春红品红染色液染色2 min；按蒸馏 水：弱酸溶液按2:1比例配置，用弱酸工作液洗涤 1 min；磷钼酸溶液洗1 min；弱酸工作液洗1 min； 再直接放入苯胺蓝染色液中2 min；弱酸工作液洗1 min；最后封片，光学显微镜下观察。

收集脱细胞软骨骨粉，冷冻干燥 过夜，用导电胶带将样品粘在铜片座上，对样品喷 金处理后，用SEM观察骨粉形态。

以脱 细胞软骨粉、10% GelMA（取代度75%）前体为原料， 按不同比例（0:100、20:80、35:65、45:55、50:50） 均匀混合，加入 0.5%（w/v）光引发剂[2-羟基-4’- （2-羟乙氧基）-2-甲基苯丙酮]，在聚四氟乙烯模具 上用光强为18 mW/cm2 ，波长为365 nm的紫外光交 联制备脱细胞软骨/GelMA复合支架（厚1 mm，直径 8 mm）。

①溶胀性能检测：将复 合支架放入37 ℃ PBS中，分别在5 min、10 min、 20 min、30 min、1 h、2 h、4 h称重，称重前用滤 纸将表面溶液吸干，记支架质量为Wt。达溶胀平衡 的支架放入冷冻干燥机中冻干24 h，称重记质量为 W0。按下述公式计算支架质量溶胀P（w），重复3次， P（w）=Wt/W0。

②储能模量检测：用DHR流变仪8 mm 的平行板夹具，设置1%的形变，37 ℃下，在0.1～ 10 Hz范围内进行振荡频率扫描测试，测不同骨粉 含量支架的储能模量，每组3个重复样品。

首先进行骨粉灭菌： 将天然软骨骨粉、脱细胞软骨骨粉，浸入 75%乙醇 溶液中灭菌24 h，之后离心去上清液，将骨粉放入 冷冻干燥机中干燥过夜。将GelMA溶于PBS缓冲液中， 配制成10% GelMA溶液，在生物安全柜中用0.22 μm 的滤膜对其进行过滤，将过滤的光引发剂加入其 中，浓度为 0.5%，按上述不同比例均匀混合软骨 骨粉和 GelMA溶液，在 96 孔板中制备复合材料支 架。在每个含有支架的孔板上，接种 5 000个人骨 髓间充质干细胞，在 37 ℃，5% CO2培养箱中用低 糖DMEM+10%胎牛血清+1%青霉素链霉素培养基培养 5 d，培养基每3 d更换1次。分别在第1、第3、第5 天用CCK-8细胞增殖毒性检测试剂盒检测细胞活性。

使用Live/ Dead试剂盒评估支架上细胞活力。取细胞接种后第 1、第7、第14天样品评估活力。设置激发/发射滤 片488/530 nm观察活细胞（绿色），530/580 nm观察 死细胞（红色）。Live/Dead试剂盒使用步骤：先根 据说明书配置Live/Dead检测工作液；吸去样品中 培养基后加入200 μL Live/Dead检测工作液，室温 避光孵育25 min；吸去染液后用无菌PBS清洗3遍， 加入1 mL PBS溶液，荧光显微镜下观察拍照。

取干细胞 接种后第 7、第 14 d的样品，用 4%多聚甲醛固定， PBS清洗3遍。室温下用0.1%的Triton处理20 min后， 避光下用罗丹明标记的鬼笔环肽（浓度为1:200）标 记细胞骨架15 min，用PBS洗3次，DAPI工作液细胞 核染色15 min。再用PBS清洗3次，加入1 mL PBS后， 用荧光显微镜观察（红色荧光为细胞骨架染色，蓝 色荧光为细胞核染色）。

采用SPSS24.0软件进行统 计学分析。计量资料以 ±s表示，2组比较采用t检 验，多组比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差 异有统计学意义。 2 结果 2.1 脱细胞效果 DAPI染色结果显示，天然软骨 组织可见细胞核成分，而脱细胞软骨组织几乎无细 胞核成分存在。进一步DNA含量检测显示， 天然软骨DNA含量为161.2 ng/mg，而脱细胞软骨 DNA含量为15.27 ng/mg，与天然软骨组织比较差异 有统计学意义。

骨关节炎以关节软骨丢失为特征，与骨肥大和 囊膜增厚有关，表现为关节疼痛、压痛、活动受限、 龟裂、渗出、局部炎症，可发生在任何关节，最常见 的是膝、髋关节和手、脚、脊柱等处的关节。60岁 以上男性发病率为9.6%，女性发病率为18%。在美 国，30%成年人都会受关节疼痛、肿胀或运动受限的 影响。传统的软骨修复方法，有微骨折手术、软 骨下钻孔术、骨软骨移植术、骨膜移植术等。微骨 折术、软骨下钻孔术恢复周期长，形成的是无序的 纤维软骨，在组织学上纤维软骨与正常透明软骨不 同，导致疗效不佳。自体骨软骨移植手术简单， 是一次性手术，但是供源不足，难以维持软骨细胞表型，不能用于修复超过2 cm2的缺损。同种异 体骨移植可修复较大面积缺损，但会引起免疫排斥 反应，存在疾病传播风险。组织工程的发展解决 了软骨修复的众多难题，然而异种生物材料植入灵 长类体内后会发生特有的超急性排斥反应，该排异 反应与异种内皮细胞表面α-1，3-半乳糖基糖蛋白分 子有关。由于灵长类动物没有该糖分子，因此体内 有大量的α-1，3-半乳糖基糖蛋白分子的抗体存在。 这些抗体迅速激活补体反应，破坏异种组织内皮细 胞而引起超急性排异反应。

本研究采用的α-1，3-半 乳糖苷转移酶基因敲除猪，具有低免疫原性，对其 肋软骨脱细胞处理，保留了细胞外基质的同时进一 步降低了免疫原性。尽管脱细胞过程能除去90%细 胞，去除大部分异种抗原，但不能完全清除干净， 异种组织仍会残留一小部分抗原，该基因敲除猪能从根源上降低免疫原性，不管在细胞内还是细胞外 基质中都不存在α-1，3-半乳糖基糖蛋白分子，因而 大大降低了异种生物材料移植的风险。美国麻省 总医院已成功将基因敲除猪的肾脏、心脏移植到狒 狒，克服了超急性免疫排斥反应。