人工感染小鼠脑部模型的建立应用

粪肠球菌为革兰阳性球 菌，在 外 界 环 境 中 的 生 存能力非常的强，属于动物肠道内正常菌群，可作为 益生菌 用 于 调 节 肠 道 的 微 生 态。 中 国 农 业 部 ２０１７年公布的《允许使用的饲料添加剂品种目录》 中，肠球菌作为一种饲料级微生物添加剂被成功收录。

快速革兰染液，珠海贝索生物科 技有限公司产品；无 水 乙 醇、二 甲 苯，天 津 永 晟 精 细 化工有限 公 司 产 品；石 蜡，中国上海标本模型厂产 品；中性树胶，中国上海懿洋仪器有限公司产品；２× ｍａｓｔｅｒＰＣＲ Ｍｉｘ、ＤＮＡ ＭａｒｋｅｒＤＬ２０００，东胜创新 生物科技有限公司产品；脑心浸出液肉汤，青岛高科 技工业园海博生物技术有限 公 司 产 品；ＰＢＳ磷 酸 盐 缓冲液，南京森贝伽生物科技有限公司产品。

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石河子大学动物科技学院传染 病实验 室 保 存 的 致 羔 羊 脑 膜 炎 粪 肠 球 菌 （命 名 为 ＸＪ１）。

体重１８ｇ～２２ｇ健康昆明小鼠 （雌雄各半），由新疆医科大学实验动物中心提供。

保存于实验室的粪肠球菌从 －８０ ℃的低温冰箱中取出，于冰上溶解。并在超净 工作台中使用接种环挑取菌液在 ＢＨＩ固体平板培养 基上四区划线，倒置于３７℃恒温培养箱１８ｈ～２４ｈ。

挑取平 板上培养出来的单个菌落，无 菌 接 入５００ ｍＬ 灭 菌 的装有 ＢＨＩ液体培养基的锥形瓶中，置 于３７ ℃摇 床中培养１２ｈ。将 菌 液 无 菌 操 作 分 装 入５０ｍＬ 的 离心管中，于４ ℃、８０００ｒ／ｍｉｎ离心８ｍｉｎ，收集菌 体并用灭 菌 的 ＰＢＳ冲 洗 菌 体，重 复２次，最 后 将 所 有菌体收集于１个５０ｍＬ的离心管中，用４０ｍＬ的 ＰＢＳ缓冲液悬浮，置于４ ℃保存备用。

准备８个无菌的１．５ｍＬ 的 ＥＰ管，编号１～８，分别加入０．９ｍＬ灭菌的 ＰＢＳ 缓冲液，将 ＰＢＳ悬 浮 的 菌 液 充 分 振 荡 混 匀，从 中 吸 取０．１ｍＬ菌液加入１号ＥＰ管中，振荡混匀，再从１ 号 ＥＰ管中吸取０．１ｍＬ 菌液加入２号 ＥＰ管中，振 震荡混匀，依次类推 做１０倍 倍 比 稀 释，即 分 别 稀 释 至１×１０－１、１×１０－２、１×１０－３、１×１０－４、１×１０－５、１ ×１０－６、１×１０－７、１×１０－８。分 别 从 １×１０－６、１× １０－７、１×１０－８ ３个 稀 释 度 的 ＥＰ 管 中 吸 取０．２ ｍＬ 菌液加入 ＢＨＩ固 体 平 板 上，用涂布棒涂布均匀，每 个梯度涂３个平板，倒置于３７ ℃恒温箱里培养一定 的时间，记录每个平板上的菌落数，菌 落 个 数 在３０ 个～３００个的平板计数有效。然后取有效计数值的 平均数根据公式（每毫升中总活菌数＝同 一 稀 释 度 ３次重复的菌落平均数×稀释倍数×５）计算得出所 培养细菌每毫升中的细菌数。

ＬＤ０、ＬＤ１００的 测 定 根据文献方 法，以６只 昆 明 小 鼠 为１组， 分别 腹 腔 注 射 ０．３ ｍＬ 菌 液，含 菌 量 为 ３．３× １０８ ＣＦＵ，记录３ｄ内 小 鼠 的 死 亡 情 况，如 果 小 鼠 全 部存活，剂量增加０．１×１０８ ＣＦＵ，若２只或２只以上 的小鼠死亡，则 剂 量 减 小０．１×１０８ ＣＦＵ，直 至 确 定 一组中只有１只昆明系小鼠 死 亡，则 与 此 剂 量 相 邻 的低剂量即为 ＬＤ０，按 照 同 样 的 方 法 给 另 一 组 小 鼠注射含菌量 为２．０×１０９ ＣＦＵ，如 果 全 部 死 亡，则 减 少剂量０．１×１０９ ＣＦＵ，若有２只或２只以上存活，则 增加剂量０．１×１０９ ＣＦＵ，直至确定只有，１只小鼠存 活的剂量，则与此相邻的最高剂量即为 ＬＤ１００。最终 测 得 ＬＤ０ 为 ４．９×１０８ ＣＦＵ，ＬＤ１００ 为 １．０５× １０９ ＣＦＵ。

通过菌 落 计 数，稀 释 倍 数 为１０－７时，平 板 上 菌 落数分别为３１、３３、３５，平均为３３个，根据公式（每毫 升中总 活 菌 数＝同一稀释度三次重复的菌落平均 数×稀 释 倍 数 ×５）计 算 出 菌 液 浓 度 为 ３．３×１０９ ＣＦＵ／ｍＬ。腹腔注射小鼠后，临床症状表现为精神萎靡、食欲 减退、闭目不睁、喜卧扎堆，可在４８ｈ内死亡，７２ｈ后存 活的小鼠逐渐恢复正常，症状消失。对死亡小鼠剖检， 发现脑部水肿，肝脏肿大呈暗黄色，肺脏水肿。脑组织中细菌的回收鉴定 粪 肠 球 菌 感 染 小鼠后，从脑组织和内脏组织中分离得到的细菌在 ＢＨＩ琼脂平板上生长良好，形态大小基本一致，为乳 白色的表面 光 滑、整 齐 的 小 菌 落（图１）。细 菌 经 革 兰染色，可以观察到呈单个、成对或者短链状排列的 革兰阳性球菌。综合粪肠球菌感染小鼠后的死亡情况，脑 组 织 的病理变化结果，认为２／３ＬＤ５０剂量作为建立粪肠 球菌感染小鼠模型的最佳剂量较为合适。

粪肠球菌是一 种 革 兰 阳 性 球 菌，为 人 和 动 物 肠 道内的正常 菌 群，通常不引起发病，当 机 体 的 免 疫力低下时，粪肠球菌可能会趁虚而入，变成致病菌 侵入机体，造 成 感 染 引 发 疾 病。近 年 来，越 来 越 多的病例报道表明，肠球菌不仅可以引起尿道感染、 心内膜 炎 等，还可以引起败血症和脑膜炎，狄 婷 婷报道，粪肠球菌可致雏鹅或青年鹅发生昏睡、 持续性下痢、跛行和瘫痪为主要症状，以败血症为主 要病理特征的传染性疾病；刘艳等报道粪肠球菌 感染一名５岁 女 童 发 生 化 脓 性 脑 膜 炎；齐 亚 银 等 报道羔羊脑膜炎中分离出了粪肠球菌１１株，并在小 鼠的回归试验中检测到分离 菌，腹 腔 注 射 小 鼠 后 均 能对其造成与发病羊相同的症状，包括精神沉郁、呼 吸急促、有 神 经 症 状，脑 部 出 血、水 肿 等。据 Ｃｏｑｕｅ Ｔ Ｍ 等报道，由粪肠球菌引起医院内的尿路感染 患病率为１６％，仅次于大肠埃希菌；在引起心内 膜炎的医院院内肠球菌感染中，有 ９３％ 为 粪 肠 球 菌；引起败血症的肠球菌，８７％为粪肠球菌，但关于肠球菌引起动物脑炎、脑膜炎的病例少有报道，其 致病机制尚不明确，因此也给肠球菌的治疗和预防 带来了困难。