微生物限度检查方法验证实验

保妇康栓是由莪术油、冰片等制成的中药栓剂，主治行 气破瘀、生肌止痛，用于治疗湿热瘀滞所致的带下病、霉 菌 性阴道炎、宫 颈 糜 烂 等。由于莪术油有一定的抑菌性， 不能按照常规法进行微生物计数，需要建立新的微生物限 度计数方法，充分消除莪术油的抑菌作用，使得其作用可以 忽略不计。这样使得检测结果可以真实反映此中药栓剂的 实际污染情况。本研究主要对保妇康栓的微生物限度计 数方法和控制菌检测方法进行验证，以找到简便易行的保 妇康栓微生物检查方法。现将实验过程总结报道如下。

３ 批 保 妇 康 栓，批 号 分 别 为：２０１５０５０２，２０１５０４０７， ２０１５０９０９。生产 厂 家：海南碧凯药业有限公司。规 格 为： １．７４ｇ／粒，１４粒／盒。

铜绿假 单 孢 菌 ［ＣＭＣＣ（Ｂ）１０１０４］、金黄色葡萄球菌 ［ＣＭＣＣ（Ｂ）２６００３］、枯草芽孢杆菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）６３５０１］、黑曲 霉［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８００３］、白色念珠菌［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８００１］（以上 菌种均由浙江省食品药品检验研究院提供）。

胰酪大豆胨液体培养基（批号１７１００９）、胰酪大 豆 胨 琼 脂培养基（批 号 １７１１２５４）、沙氏葡萄糖液体培养基 （批 号 １６１０１６２）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号１６１２２５）、溴化十六 烷基三甲铵培养基（批号１６０６１８２）、甘露醇氯化钠琼脂培养 基（批号１７０６３０）、梭菌增菌培养基（１６０９０６）、哥伦比亚琼脂 培养基（批号２０１６０７２１）、念珠菌显色培养基（１６０１０４）。除 了哥伦比亚琼脂培养基由青岛高科园海博生物技术有限公 司生产外，其余均由北京三药科技开发公司生产。以 上 培养基均按照２０１５版《中华人民共和国药典》一部附录配制， １２１℃高压灭菌２０ｍｉｎ，４５℃恒温备用。

ＭＪＰ－１５０霉菌培养 箱（上海精宏实验设备有限公司）、 ＳＨＰ－０８０生化培养箱（上海精宏实验设备有限公司）、ＢＳＣ－ １０００ＩＩＢ２生物安 全 柜（苏州安泰空气技术有限公司）、ＹＪ－ ８７５Ｓ／ＤＢ净化 工 作 台 （吴江市雄峰空调净化设备有限公 司）、ＤＫ－６００电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司）、 ＭＪ－５４Ａ 高压 灭 菌 器 （上海施都凯仪器设备有限公司）、 １０１Ａ－３电热恒温干燥箱 （杭州卓驰仪器有限 公 司 ）、 ＴＤ２００１Ｂ电子天平（余姚市金诺天平仪器有限公司）。

①分别取接种有金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草 芽孢杆菌培养物的胰酪大豆胨琼脂斜面的试管各一支，加３ ～５ｍＬ０．９％ 无菌氯化钠溶液冲洗斜面，吸 出 菌 液，取 出 １ｍＬ菌液加０．９％无菌氯化钠溶液９ｍＬ，采用１０倍递增稀 释法，稀 释 至 １０－５ ～１０－７，使得菌落数约为 １０～１００ｃｆｕ· ｍＬ－１；

②分别取接种有白色念珠菌、黑曲霉培养物的沙氏葡 萄糖琼脂斜面的试管各一支，加３～５ｍＬ０．９％无菌氯化钠 溶液冲洗斜面，吸出菌液，取出１ｍＬ菌液加０．９％无菌氯化 钠溶液９ｍＬ，采用１０倍递增稀释法，稀释至１０－４ ～１０－６，使得 菌落数约为１０～１００ｃｆｕ·ｍＬ－１。

２．２ 供试液制备
 

取本品１０ｇ，加胰酪大豆胨液体培养基至４００ｍＬ，再加 入１％的吐温８０（经过高温灭菌），振荡器振摇至供试品分散 均匀，制成１∶４０的供试液。

（１）需氧菌计数方法 验证：供试品稀释→平皿法：

    ①菌液组：采用平皿计数法，分 别取各菌液１ｍＬ，每个菌株平行注入２个平皿。测定上述 制备好的菌液中的菌落数；

    ②供试品组：分 别取１∶４０供试液１ｍＬ注入２个平皿，分别测定供试品的 需氧菌数，结果 见 表 ３；

    ③ 试 验 组：按照供试品组的方法操 作，再分别取上述菌液１ｍＬ（约３０～１００ｃｆｕ·ｍＬ－１），分别注 入各个平皿中，测定结果见表４。以上３组已注入供试液的 平皿（其中试验组在注入供试液和菌液后应立即倾注培养 基），需氧菌计数，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，待 凝 固 后， ３４℃培养３天逐日观察结果。霉菌和 酵 母 菌 计 数，倾 注 沙 氏葡萄糖琼脂 培 养 基，待 凝 固 后，２４℃ 培 养 ５天 逐 日 观 察 结果。

    ①菌液组：采用与上述 “需氧菌计数方法验证”相同的操作；

    ②供试品组：分别取１ ∶４０供试液１ｍＬ 注 入 平 皿，测定供试品的霉菌和酵母菌 数；

    ③试验组：同上述“需氧菌计数方法验证”相同操作。

（３）稀释剂组的方法验证。供试品换成胰酪大豆胨液 体（已 加 高 温 灭 菌 １％ 的 吐 温 ８０），方 法 同 供 试 品。

因为保妇康栓产品说明书中含莪术油，主 要 治 疗 霉 菌 性阴道炎、老年性 阴 道 炎、宫 颈 糜 烂 等，说明此栓剂有一定 的抑菌作用，供试品溶液（１∶１０）采用平皿法计数，意 义 不 大。于是对前期供试品溶液（１∶２０）采用平皿法计数，无法 通过适用性检查，回收率如表１所示。

　从表１中看出，金黄色葡萄球菌和白色念珠菌回收率＜５０％，表明此栓剂对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌有抑 制作用。　保妇康栓的菌检计数方法如果采用供试液稀释法，方 法如下：取１∶４０的供试液１ｍＬ注入平皿，测定需氧菌数； 取１∶４０的供试液１ｍＬ注入平皿，测定霉菌和酵母菌数。

本研究采用供试品稀释→平皿法对保妇康栓微生物限 度计数方法进行验证，如果采用培养基稀释法把１ｍＬ供试 液（１∶１０）吸取到０．５ｍＬ／平皿、０．２ｍＬ／平皿时，使用的玻 璃平皿数量较多，且操作繁琐易污染，直接把原样品直接稀 释到１∶２０或者１∶４０进行日常的微生物限度检查，这样平 皿数量可以大为减少。 由于保妇康栓组成中有莪术油，它具有一定的抗炎抑 菌作用，所以进行微生物限度检查时必须对计数方法进行 比较、验证，确保方法安全稳定，结果可靠。 薄膜过滤法由于预实验中栓剂无法顺利通过薄膜，过 滤膜后的培养结果不理想，所以没有进行方法比 较。２０１５ 版药典中微生物计数法的计数方法新增了 ＭＰＮ 法，用于微 生物计数时 ＭＰＮ 法的精确度比较差。ＭＰＮ 法的准确 度 和精密度不及平皿计数法，而且霉菌计数也不能使用此方 法，仅在没有适宜计数方法对供试品需氧菌总数进行实验 的情况下方能使用。因此，本研究未对 ＭＰＮ 法进行研究。